表達(dá)延邊飼養(yǎng)鵝α干擾素基因重組禽痘病毒的構(gòu)建及表達(dá)產(chǎn)物對(duì)鵝細(xì)小病毒活性影響的初步研究.pdf

1、干擾素(Interferon，IFN)是由機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生的一類具有抗腫瘤、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫功能等多種生物活性的糖蛋白，是機(jī)體防御系統(tǒng)的重要組成部分。在眾多干擾素類型中，a干擾素具有廣譜的抗病毒活性和良好的免疫調(diào)節(jié)作用，能夠增強(qiáng)機(jī)體的免疫力。
　　為了開展延邊飼養(yǎng)鵝α干擾素基因及其重組載體疫苗的研究，本試驗(yàn)應(yīng)用植物血凝素（PHA）刺激延邊飼養(yǎng)鵝外周血單核細(xì)胞，提取總RNA，采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增編碼鵝α干擾素的基因，將目的基因經(jīng) T

2、A克隆后進(jìn)行序列測(cè)定分析，將測(cè)序正確的經(jīng)雙酶切，構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒 pET-30a-IFN-α，并在大腸桿菌 BL21（DE3）中獲得表達(dá)，對(duì)表達(dá)融合蛋白進(jìn)行 SDS-PAGE和 Western-blot分析鑒定，將蛋白純化后免疫BALB/c小鼠，制備鼠抗延邊飼養(yǎng)鵝a干擾素成熟蛋白多克隆抗體，通過瓊脂糖擴(kuò)散試驗(yàn)經(jīng)行效價(jià)檢測(cè)。結(jié)果表明，擴(kuò)增的鵝α干擾素基因全長(zhǎng)576 bp，編碼192個(gè)氨基酸；成功構(gòu)建了重組原核表達(dá)載體pET-30a-I

3、FN-α，表達(dá)的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE和Western-blot檢測(cè)，分子質(zhì)量大小約為29 ku，并具有良好的反應(yīng)原性；成功制備鼠抗鵝 a干擾素成熟蛋白多克隆抗體，瓊脂糖擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)效價(jià)為1:32。
　　為了研究表達(dá)延邊飼養(yǎng)鵝α干擾素基因重組活載體疫苗的抗病毒活性，本試驗(yàn)通過RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增得到延邊飼養(yǎng)鵝α干擾素基因，利用基因重組技術(shù)構(gòu)建了pSY681-LP2EP2- IFN-α-Lac轉(zhuǎn)移載體,采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法將該重組

4、質(zhì)粒與禽痘病毒 FPV-017共轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞（CEF），進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，收獲純化的重組病毒，并進(jìn)行重組病毒α干擾素基因的PCR鑒定及重組病毒的間接免疫熒光(IFA)和Western blot檢測(cè)，通過細(xì)胞病變分析干擾素的抗病毒活性。結(jié)果顯示，成功制備了重組禽痘病毒rFPV-IFN-α，PCR結(jié)果顯示成功將延邊飼養(yǎng)鵝α干擾素基因亞克隆到禽痘病毒載體，間接免疫熒光和Western blot檢測(cè)表明延邊飼養(yǎng)鵝α干擾素基因在 CEF中成功