阻斷B7-CD28共刺激通路抑制大鼠肝移植急性排斥反應(yīng)的研究.pdf

1、[研究背景] 肝臟移植是治療終末期肝病的最佳方法乃至唯一的選擇。決定肝臟移植成敗的關(guān)鍵性問(wèn)題之一是受體對(duì)移植器官的排斥反應(yīng)，受體對(duì)移植器官的排異反應(yīng)根源于T淋巴細(xì)胞的激活和增生。近年研究發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞的激活依賴于抗原遞呈細(xì)胞提呈的雙重信號(hào)：由抗原本身所介導(dǎo)的第一信號(hào)和共刺激分子(costimulatory molecule)介導(dǎo)的第二信號(hào)。第一信號(hào)是指抗原呈遞細(xì)胞(antigene present cell，APC)呈遞的抗原肽-

2、主要組織相容性復(fù)合物(maior histocompatibility complex，MHC)，與特殊的T細(xì)胞受體(T cell receptor TCR)相結(jié)合，將信號(hào)傳遞給T細(xì)胞，第一信號(hào)即被激活；第二信號(hào)是共刺激信號(hào)(co-stimulation signal)，即來(lái)自APC上的B7家族分子與其在T細(xì)胞上的配體CD28家族分子相結(jié)合產(chǎn)生的協(xié)同刺激信號(hào)。共刺激分子具有啟動(dòng)、維持以及調(diào)節(jié)活化級(jí)連反應(yīng)的作用，決定了細(xì)胞是活化增殖，還是

3、抑制或者轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)反應(yīng)狀態(tài)(anergy)，甚至凋亡(apoptosis)<'[2]>。任何一種信號(hào)的缺乏都不能達(dá)到引起T淋巴細(xì)胞的分化、增生以至排斥移植器官的免疫應(yīng)答反應(yīng)。T淋巴細(xì)胞所介導(dǎo)的排斥反應(yīng)需要識(shí)別特異的抗原和細(xì)胞粘附分子介導(dǎo)的共刺激信號(hào)。共刺激信號(hào)對(duì)供體器官免疫排異反應(yīng)的影響主要依賴于共刺激分子在抗原呈遞細(xì)胞表面的表達(dá)。在器官移植中對(duì)供體器官的抗原是難以控制和調(diào)節(jié)的，阻斷共刺激信號(hào)已經(jīng)被證實(shí)為有效的抑制排異反應(yīng)的方法。

4、 所有的B7樣分子和它們的受體都是Ⅰ型跨膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族。B7家族各成員之間有20﹪-35﹪氨基酸序列是相同的。B7-1(CDS0)和B7-2(CD86)是研究得最廣泛的T細(xì)胞協(xié)同刺激分子，二者分別結(jié)合的受體包括CD28、CTLA-4、ICOS、PD-1(程序性死亡分子)和BTLA(B、T細(xì)胞弱化因子)。所有這些協(xié)同信號(hào)分子不僅提供促進(jìn)T細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和產(chǎn)生細(xì)胞因子的正向信號(hào)(CD28和ICOS)，同時(shí)還能通過(guò)提供負(fù)向信號(hào)

5、來(lái)限制、終止和/或減弱T細(xì)胞應(yīng)答(CTLA-4、PD-1和BTLA)。改變這些協(xié)同分子的表達(dá)可以調(diào)控免疫的強(qiáng)度和方向。CTLA-4是研究得最為透徹的識(shí)別B7家族成員的抑制性受體，屬CD28超家族成員，在氨基酸水平與CD28有31﹪的同源性。CTLA-4通過(guò)降低細(xì)胞因子IL-2和IL-2R的表達(dá)及使細(xì)胞阻滯于G l期來(lái)抑制T細(xì)胞的活化。 CTLA-4Ig是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(CTIA-4)與IgG Fc段的基因重組融合蛋白，IJ

6、nsley等在1991年首次報(bào)導(dǎo)用基因工程方法制備出可溶性重組CTLA-4Ig融合蛋白，它能夠阻斷抗原特異性T細(xì)胞活化過(guò)程所必需的B7-CD28共刺激通路，導(dǎo)致抗原特異性T細(xì)胞無(wú)能或凋亡，對(duì)控制器官移植排斥反應(yīng)的發(fā)生具有重要作用<'[7]>。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)利用CTIA-4Ig對(duì)介導(dǎo)大鼠原位肝移植(：ROLT)急性排斥反應(yīng)起關(guān)鍵作用的細(xì)胞免疫反應(yīng)的第二信號(hào)進(jìn)行阻斷，應(yīng)用免疫組織化學(xué)和RT-PCR半定量技術(shù)分別檢測(cè)B7-1和B7-2蛋白及B7-

7、1和：B7-2 mRNA的表達(dá)情況，觀察CTLA-4Ig抑制供體肝細(xì)胞共刺激分子B7-1和B7-2的表達(dá)，以阻斷抗原呈遞細(xì)胞刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)引起免疫應(yīng)答所必需的共刺激信號(hào)，達(dá)到抑制受體對(duì)供肝的免疫排斥反應(yīng)，從而進(jìn)一步探討動(dòng)態(tài)檢測(cè)B7分子的表達(dá)有助于觀察肝移植排斥反應(yīng)的進(jìn)程。就所查的文獻(xiàn)，國(guó)內(nèi)尚未檢索到關(guān)于肝移植術(shù)后共刺激分子B7表達(dá)與急性排斥反應(yīng)進(jìn)程關(guān)系研究的論文或報(bào)道。 [目的]：建立大鼠原位肝移植(ROLT)急性排斥反應(yīng)模型

8、，觀察應(yīng)用CTIA-4Ig在大鼠肝移植術(shù)后對(duì)共刺激分子：B7-1和：B7-2的影響及其抗排斥反應(yīng)的作用，探討B(tài)7分子與移植后排斥反應(yīng)進(jìn)程的關(guān)系。 [方法]： 1．雄性近交系DA大鼠48只，購(gòu)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重180-200g；雄性近交系Lewis大鼠48只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，體重160-200g；CTLA4-Ig購(gòu)于BD Pharmingen公司；純化抗大鼠CD80單克隆抗體、純化抗大鼠C

9、D86單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)BioLegend公司；RT-PCR試劑盒購(gòu)自TOYOBO公司。 2．采用“二袖套管”法，建立DA→Lewis大鼠配對(duì)組合的ROLT急性排斥反應(yīng)模型，動(dòng)物術(shù)前12h禁食不禁水。凡ROLT術(shù)后存活48h以上者納入本研究，并按隨機(jī)表法分為2組。實(shí)驗(yàn)分為A組：對(duì)照組(n=48)：：DA→Lewis ROLT模型，術(shù)后48h腹腔內(nèi)一次性注射生理鹽水1ml，未進(jìn)行任何治療；B組：CTLA4-Ig組(n=48)：DA

10、→Lewis ROLT模型，于術(shù)后48h腹腔內(nèi)一次性注射CTLA4-Ig，75 μg/只大鼠。然后2組動(dòng)物分別于移植術(shù)后3，5，7，10d各隨機(jī)選取6 只處死收集血清標(biāo)本與肝臟標(biāo)本。 3．一般情況觀察觀察2組受體鼠術(shù)后的精神狀態(tài)，運(yùn)動(dòng)，食欲，耳廓和皮膚黃染程度，以及小便顏色。 4．2組受體鼠分別于移植術(shù)后第3、5、7、10d天剖腹經(jīng)腹主動(dòng)脈取血3～6ml，于低溫離心機(jī)3000 r/min離心15min，取血清，分裝后于-70℃冰

11、箱保存?zhèn)錂z。所取的所有標(biāo)本避免反復(fù)凍融，于檢測(cè)前2h置于2℃～8℃環(huán)境中解凍，所檢測(cè)的肝功能指標(biāo)有：谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、總膽紅素(TBIL)及直接膽紅素(DBIL)。 5．逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(PT-PCR)半定量：采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒(TOYOBO公司產(chǎn)品)提取組織標(biāo)本總RNA，以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)參，β-actin、B7-1和B7-2的引物序列參照Naosuke Kojima的文獻(xiàn)報(bào)道，由上海鼎安科技

12、有限公司合成。β-actin上游引物為：5’-ATGGARTCCTGTGGCATCCA-3’，下游引物為：5’-CGCTCAGGAGGAGCAATGAT-3，擴(kuò)增產(chǎn)物224bp；B7-1上游引物為：5’GGCATTGCTGTCCTGTGATTAC 3’，下游引物為：5’ACTCAGTTATGTTGGGGGTAGG 3’，擴(kuò)增產(chǎn)物314bp；B7-2上游引物為：5’GCTCGTAGTATTTTGGCAGGACC 3’，下游引物為：5’CG

13、GGTATCCTTGCTTAGATGAGC 3’，擴(kuò)增產(chǎn)物337bp。兩步法RT-PCR反應(yīng)檢測(cè)B7-1、B7-2 mRNA表達(dá)。1﹪瓊脂糖凝膠電泳，Alpha Imager <'TM> 2200凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳條帶存入圖像。以系統(tǒng)的SPOT DENSITY軟件分別測(cè)量?jī)?nèi)參照和B7-1、B7-2基因擴(kuò)增條帶的密度，以B7-1、B7-2條帶的密度與內(nèi)參照管家基因的密度比值代表基因表達(dá)的相對(duì)水平，作擴(kuò)增產(chǎn)物半定量分析。 6．免疫

14、組化：應(yīng)用免疫組織化學(xué)SABC法，檢測(cè)48例肝臟組織中B7-1、B7-2蛋白表達(dá)情況，分析B7-1、B7-2蛋白表達(dá)與肝移植急性排斥反應(yīng)的關(guān)系。 [結(jié)果]： 1．對(duì)照組動(dòng)物于術(shù)后3-4d起開(kāi)始出現(xiàn)體重減輕，皮膚、耳廓黃染逐漸加深，行動(dòng)遲緩，尿色深黃，7 d以后精神明顯萎靡，消瘦，毛發(fā)蓬亂、脫落； 在術(shù)后7～14d內(nèi)出現(xiàn)死亡，尸檢發(fā)現(xiàn)，肝臟脾臟腫脹嚴(yán)重，腹腔內(nèi)腹水不明顯，套管及膽道支撐管無(wú)脫落、扭曲，無(wú)腹腔內(nèi)出血等

15、手術(shù)操作失誤致死因素。CTLA4-Ig組動(dòng)物術(shù)后7d內(nèi)亦表現(xiàn)為精神較差，體質(zhì)量減輕，但尿色清亮，無(wú)明顯皮膚、耳廓黃染；7d以后精神食欲逐漸恢復(fù)正常，體重逐漸增加。 2.各組大鼠于術(shù)后3、5、7、10天檢測(cè)血清ALT、TBIL、DBIL指標(biāo)，A組肝功能損傷明顯，B組肝功指標(biāo)各時(shí)像點(diǎn)之間變化不明顯，其3項(xiàng)指標(biāo)水平均明顯低于對(duì)照組(P<0.01)。 3.B7-1 mRN,A在B組低表達(dá)，而在A組則明顯表達(dá)(P<0.01)；B7-2 m

16、RNA在B組低表達(dá)，而在A組則明顯表達(dá)(P<0.01)。各組間觀察，可見(jiàn)B7-1mRNA和B7-2 mRNA表達(dá)隨時(shí)間的延長(zhǎng)、肝移植排斥反應(yīng)的進(jìn)展而逐漸增強(qiáng)。 4.B7-1在B組低表達(dá)，而在A組明顯表達(dá)(P<0.01)；B7-2在B組低表達(dá)，而在A組明顯表達(dá)(P<0.01)。 [結(jié)論]： 1.B7-1和B7-2成為抑制肝移植急性排斥反應(yīng)的新靶點(diǎn)。 2.肝移植急性排斥反應(yīng)大鼠之肝臟，共刺激分子B7-1和B7