阻斷B7-CD28共刺激通路抑制大鼠肝移植急性排斥反應的研究.pdf

1、[研究背景] 肝臟移植是治療終末期肝病的最佳方法乃至唯一的選擇。決定肝臟移植成敗的關(guān)鍵性問題之一是受體對移植器官的排斥反應，受體對移植器官的排異反應根源于T淋巴細胞的激活和增生。近年研究發(fā)現(xiàn)，T細胞的激活依賴于抗原遞呈細胞提呈的雙重信號：由抗原本身所介導的第一信號和共刺激分子(costimulatory molecule)介導的第二信號。第一信號是指抗原呈遞細胞(antigene present cell，APC)呈遞的抗原肽-

2、主要組織相容性復合物(maior histocompatibility complex，MHC)，與特殊的T細胞受體(T cell receptor TCR)相結(jié)合，將信號傳遞給T細胞，第一信號即被激活；第二信號是共刺激信號(co-stimulation signal)，即來自APC上的B7家族分子與其在T細胞上的配體CD28家族分子相結(jié)合產(chǎn)生的協(xié)同刺激信號。共刺激分子具有啟動、維持以及調(diào)節(jié)活化級連反應的作用，決定了細胞是活化增殖，還是

3、抑制或者轉(zhuǎn)變?yōu)闊o反應狀態(tài)(anergy)，甚至凋亡(apoptosis)<'[2]>。任何一種信號的缺乏都不能達到引起T淋巴細胞的分化、增生以至排斥移植器官的免疫應答反應。T淋巴細胞所介導的排斥反應需要識別特異的抗原和細胞粘附分子介導的共刺激信號。共刺激信號對供體器官免疫排異反應的影響主要依賴于共刺激分子在抗原呈遞細胞表面的表達。在器官移植中對供體器官的抗原是難以控制和調(diào)節(jié)的，阻斷共刺激信號已經(jīng)被證實為有效的抑制排異反應的方法。

4、 所有的B7樣分子和它們的受體都是Ⅰ型跨膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族。B7家族各成員之間有20﹪-35﹪氨基酸序列是相同的。B7-1(CDS0)和B7-2(CD86)是研究得最廣泛的T細胞協(xié)同刺激分子，二者分別結(jié)合的受體包括CD28、CTLA-4、ICOS、PD-1(程序性死亡分子)和BTLA(B、T細胞弱化因子)。所有這些協(xié)同信號分子不僅提供促進T細胞生長、分化和產(chǎn)生細胞因子的正向信號(CD28和ICOS)，同時還能通過提供負向信號

5、來限制、終止和/或減弱T細胞應答(CTLA-4、PD-1和BTLA)。改變這些協(xié)同分子的表達可以調(diào)控免疫的強度和方向。CTLA-4是研究得最為透徹的識別B7家族成員的抑制性受體，屬CD28超家族成員，在氨基酸水平與CD28有31﹪的同源性。CTLA-4通過降低細胞因子IL-2和IL-2R的表達及使細胞阻滯于G l期來抑制T細胞的活化。 CTLA-4Ig是細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4(CTIA-4)與IgG Fc段的基因重組融合蛋白，IJ

6、nsley等在1991年首次報導用基因工程方法制備出可溶性重組CTLA-4Ig融合蛋白，它能夠阻斷抗原特異性T細胞活化過程所必需的B7-CD28共刺激通路，導致抗原特異性T細胞無能或凋亡，對控制器官移植排斥反應的發(fā)生具有重要作用<'[7]>。本實驗通過利用CTIA-4Ig對介導大鼠原位肝移植(：ROLT)急性排斥反應起關(guān)鍵作用的細胞免疫反應的第二信號進行阻斷，應用免疫組織化學和RT-PCR半定量技術(shù)分別檢測B7-1和B7-2蛋白及B7-

7、1和：B7-2 mRNA的表達情況，觀察CTLA-4Ig抑制供體肝細胞共刺激分子B7-1和B7-2的表達，以阻斷抗原呈遞細胞刺激機體免疫系統(tǒng)引起免疫應答所必需的共刺激信號，達到抑制受體對供肝的免疫排斥反應，從而進一步探討動態(tài)檢測B7分子的表達有助于觀察肝移植排斥反應的進程。就所查的文獻，國內(nèi)尚未檢索到關(guān)于肝移植術(shù)后共刺激分子B7表達與急性排斥反應進程關(guān)系研究的論文或報道。 [目的]：建立大鼠原位肝移植(ROLT)急性排斥反應模型

8、，觀察應用CTIA-4Ig在大鼠肝移植術(shù)后對共刺激分子：B7-1和：B7-2的影響及其抗排斥反應的作用，探討B(tài)7分子與移植后排斥反應進程的關(guān)系。 [方法]： 1．雄性近交系DA大鼠48只，購自哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物中心，體重180-200g；雄性近交系Lewis大鼠48只，購自北京維通利華實驗動物有限公司，體重160-200g；CTLA4-Ig購于BD Pharmingen公司；純化抗大鼠CD80單克隆抗體、純化抗大鼠C

9、D86單克隆抗體購自美國BioLegend公司；RT-PCR試劑盒購自TOYOBO公司。 2．采用“二袖套管”法，建立DA→Lewis大鼠配對組合的ROLT急性排斥反應模型，動物術(shù)前12h禁食不禁水。凡ROLT術(shù)后存活48h以上者納入本研究，并按隨機表法分為2組。實驗分為A組：對照組(n=48)：：DA→Lewis ROLT模型，術(shù)后48h腹腔內(nèi)一次性注射生理鹽水1ml，未進行任何治療；B組：CTLA4-Ig組(n=48)：DA

10、→Lewis ROLT模型，于術(shù)后48h腹腔內(nèi)一次性注射CTLA4-Ig，75 μg/只大鼠。然后2組動物分別于移植術(shù)后3，5，7，10d各隨機選取6 只處死收集血清標本與肝臟標本。 3．一般情況觀察觀察2組受體鼠術(shù)后的精神狀態(tài)，運動，食欲，耳廓和皮膚黃染程度，以及小便顏色。 4．2組受體鼠分別于移植術(shù)后第3、5、7、10d天剖腹經(jīng)腹主動脈取血3～6ml，于低溫離心機3000 r/min離心15min，取血清，分裝后于-70℃冰

11、箱保存?zhèn)錂z。所取的所有標本避免反復凍融，于檢測前2h置于2℃～8℃環(huán)境中解凍，所檢測的肝功能指標有：谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、總膽紅素(TBIL)及直接膽紅素(DBIL)。 5．逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(PT-PCR)半定量：采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應試劑盒(TOYOBO公司產(chǎn)品)提取組織標本總RNA，以β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參，β-actin、B7-1和B7-2的引物序列參照Naosuke Kojima的文獻報道，由上海鼎安科技

12、有限公司合成。β-actin上游引物為：5’-ATGGARTCCTGTGGCATCCA-3’，下游引物為：5’-CGCTCAGGAGGAGCAATGAT-3，擴增產(chǎn)物224bp；B7-1上游引物為：5’GGCATTGCTGTCCTGTGATTAC 3’，下游引物為：5’ACTCAGTTATGTTGGGGGTAGG 3’，擴增產(chǎn)物314bp；B7-2上游引物為：5’GCTCGTAGTATTTTGGCAGGACC 3’，下游引物為：5’CG

13、GGTATCCTTGCTTAGATGAGC 3’，擴增產(chǎn)物337bp。兩步法RT-PCR反應檢測B7-1、B7-2 mRNA表達。1﹪瓊脂糖凝膠電泳，Alpha Imager <'TM> 2200凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳條帶存入圖像。以系統(tǒng)的SPOT DENSITY軟件分別測量內(nèi)參照和B7-1、B7-2基因擴增條帶的密度，以B7-1、B7-2條帶的密度與內(nèi)參照管家基因的密度比值代表基因表達的相對水平，作擴增產(chǎn)物半定量分析。 6．免疫

14、組化：應用免疫組織化學SABC法，檢測48例肝臟組織中B7-1、B7-2蛋白表達情況，分析B7-1、B7-2蛋白表達與肝移植急性排斥反應的關(guān)系。 [結(jié)果]： 1．對照組動物于術(shù)后3-4d起開始出現(xiàn)體重減輕，皮膚、耳廓黃染逐漸加深，行動遲緩，尿色深黃，7 d以后精神明顯萎靡，消瘦，毛發(fā)蓬亂、脫落； 在術(shù)后7～14d內(nèi)出現(xiàn)死亡，尸檢發(fā)現(xiàn)，肝臟脾臟腫脹嚴重，腹腔內(nèi)腹水不明顯，套管及膽道支撐管無脫落、扭曲，無腹腔內(nèi)出血等

15、手術(shù)操作失誤致死因素。CTLA4-Ig組動物術(shù)后7d內(nèi)亦表現(xiàn)為精神較差，體質(zhì)量減輕，但尿色清亮，無明顯皮膚、耳廓黃染；7d以后精神食欲逐漸恢復正常，體重逐漸增加。 2.各組大鼠于術(shù)后3、5、7、10天檢測血清ALT、TBIL、DBIL指標，A組肝功能損傷明顯，B組肝功指標各時像點之間變化不明顯，其3項指標水平均明顯低于對照組(P<0.01)。 3.B7-1 mRN,A在B組低表達，而在A組則明顯表達(P<0.01)；B7-2 m

16、RNA在B組低表達，而在A組則明顯表達(P<0.01)。各組間觀察，可見B7-1mRNA和B7-2 mRNA表達隨時間的延長、肝移植排斥反應的進展而逐漸增強。 4.B7-1在B組低表達，而在A組明顯表達(P<0.01)；B7-2在B組低表達，而在A組明顯表達(P<0.01)。 [結(jié)論]： 1.B7-1和B7-2成為抑制肝移植急性排斥反應的新靶點。 2.肝移植急性排斥反應大鼠之肝臟，共刺激分子B7-1和B7