大鼠肝移植急性排斥反應的淋巴細胞蛋白質組學研究.pdf

1、本實驗運用雙向凝膠電泳并結合質譜技術對大鼠肝移植術后急性排斥反應模型的淋巴細胞進行研究，篩選、分析發(fā)生表達變化的蛋白質，以期了解與排斥反應相關的特異性蛋白質及它們之間的相互關系，從蛋白質水平揭示淋巴細胞在肝移植術后急性排斥反應中的分子機制。 基于上述考慮，首先建立大鼠異種基因肝移植的急性排斥動物模型，分離出模型大鼠脾臟的淋巴細胞，利用差異蛋白質組學鑒定急性排斥反應的相關功能蛋白，擬對肝移植急性排斥反應的分子機制從蛋白質水平進行系

2、統(tǒng)研究。本部分研究的具體內容總結如下： 第一部分：改良Kamada法大鼠原位肝移植模型的建立 方法：利用改良Kamada法建立穩(wěn)定的大鼠原位肝移植動物模型，模型的建立是本項研究的基礎。我們采用該方法對113只大鼠進行預試驗練習，通過總結失敗原因，試驗組的110只大鼠手術成功率和1周存活率（90.9%）明顯提高。 結果：所有數據分析采用SPSS17.0軟件完成，利用x2檢驗比較兩組術后1周生存率有顯著性差異。試驗組

3、肝上下腔靜脈的吻合時間為10～15分鐘，無肝期為18～20分鐘。術后常見的并發(fā)癥為腹腔出血、肝下下腔靜脈狹窄血栓形成、左膈下靜脈出血、膽管梗阻、門靜脈狹窄血栓形成、感染、麻醉過深以及呼吸衰竭。小結：大鼠肝移植模型是一種難度較大的手術，術中供肝的游離、灌注、冷保存，套管，受體肝臟的游離、切除、供肝置入受體后血管的吻合以及大鼠活力、解剖結構和變異等各個環(huán)節(jié)都會影響大鼠肝移植術后的存活率。我們不僅需要形成標準化的手術操作流程，而且需要術中仔細

4、、輕柔的操作和熟練的顯微外科技術。 歸納起來，我們將大鼠肝移植模型制作預防并發(fā)癥的經驗總結如下：（1）重視早期動物模型的預試驗操作，細致熟練的顯微外科技術是預防術中、術后并發(fā)癥的先決條件；（2）麻醉的深淺控制是手術成功的保障；（3）盡量縮短受體無肝期是決定術后生存率的關鍵；（4）改善術后飼養(yǎng)環(huán)境及合理的抗菌素應用是預防術后感染的必要手段。 第二部分：移植肝血清IL-2與IFN-γ水平檢測及組織切片分析 方法：在前

5、期動物模型制作的基礎上，選取10周齡Wistar大鼠6只，10周齡SD大鼠18只，體重250～300g。實驗動物清潔飼養(yǎng)，術前禁食12 h，自由飲水。Wistar大鼠作為異基因移植組供體，SD大鼠作為同基因移植組供、受體與異基因移植組受體。將6只Wistar大鼠和18只SD大鼠分成兩組。第一組：急性排斥反應組（從Wistar大鼠移植到SD大鼠，6對）；第二組：同基因移植對照組（從SD大鼠移植到SD大鼠，6對）。手術采用吸入乙醚麻醉，大鼠

6、肝移植模型采用改良Kamada“雙袖套法”，不吻合肝動脈。手術均在無菌條件下進行。抽取同基因移植對照組與急性排斥組肝移植后SD大鼠血清樣本。血清IL-2與IFN-γ水平分別用大鼠IL-2與IFN-γ ELISA試劑盒測定。移植后的肝組織用10%福爾馬林，4℃固定過夜，石蠟包埋，切片厚度為4μm，經HE染色后在光學顯微鏡下觀察其形態(tài)學變化。 結果：兩組大鼠術后均正常存活，第3d處死時未見血管或膽道并發(fā)癥。統(tǒng)計學方法采用t檢驗進行分

7、析。與同基因對照組的大鼠[IL-2：（15.36±1.07）pg/L； IFN-γ：（158.76±21.42）pg/L]相比，急性排斥組的大鼠血清IL-2[（132.43±1.20）pg/L]與IFN-γ[（809.44±123.01）pg/L]的水平表達顯著增加（P<0.05）。排斥組肝組織HE染色切片證實均有Ⅱ a～Ⅱ b級（Banff標準）排斥反應表現，而對照組肝組織HE染色切片未見排斥反應表現。 小結：將Wistar大

8、鼠肝臟移植到SD大鼠可成功誘導出大鼠急性排斥反應的動物模型。異體器官移植排異反應與受者的細胞因子網絡密切相關，有較多研究表明，Th1細胞因子如干擾素（IFN）、白介素（IL）-2等參與器官移植排異反應。本實驗中，急性排斥組的大鼠血清IL-2與IFN-γ的水平表達顯著增加。排斥組肝組織HE染色切片證實均有Ⅱ a～Ⅱ b級（Banff標準）排斥反應表現，而對照組肝組織HE染色切片未見排斥反應表現。 第三部分：淋巴細胞蛋白質樣品的制備

9、及雙向凝膠電泳分離蛋白質 方法：將脾切成碎塊，放入勻漿器，加入少許RPMI1640細胞培養(yǎng)基，反復研磨，將組織研磨成為勻漿，將組織勻漿轉移至潔凈燒杯中，用裝有1ml注射器針頭的10ml注射器反復吹打，使組織勻漿形成單個細胞。在15ml離心管中加入與組織勻漿等體積的HISTOPAQUE-1077淋巴細胞分離液，然后小心將組織勻漿加入淋巴細胞分離液上層，400 g/min離心30 min，分離出淋巴細胞，再用RPMI1640培養(yǎng)基洗

10、滌細胞三次，離心后小心用濾紙將上清吸干，將獲得的淋巴細胞置液氮中保存。按照100 mg干重淋巴細胞400Ll裂解液的比例混勻，置4℃裂解30分鐘后，離心30分鐘，取上清分裝，用2D QUANT蛋白定量試劑盒進行定量，分別對兩組蛋白質樣品進行組內等量混合，分裝凍存于液氮。用前經再次對蛋白質定量后，各取同基因移植對照組和移植急性排斥組淋巴細胞蛋白質300μg，分別與適量泡脹緩沖液混勻，總容量為340μl，加入膠條槽，以24cm，pH3～10

11、的IPG干膠條覆蓋，置于IPGphor水平電泳儀電極板上，在20℃，每膠50 mA的條件下等電聚焦電泳，總電壓時間積約為53，000 Vh；然后平衡膠條各10分鐘，置12.5% SDS凝膠進行垂直電泳分離，以Coomassie bri12liant blue G2250對凝膠做膠體考染，用超純水脫色至干凈。每組實驗重復3次。用Image Scanner掃描儀以及Lab Scan掃描軟件掃描凝膠，獲取300dpi分辨率圖像，以ImageM

12、aster2D Elite圖像分析軟件進行圖像分析，經蛋白質斑點檢測、標準化和匹配做差異分析后得出差異蛋白質點的數據信息，采用t檢驗分析數據。與對照組相比，差異蛋白表達水平比值變化超過1.5倍以上的被認為有意義的差異點并被選取用來質譜分析。對質譜分析得到的差異蛋白點進行Western blot驗證。從各組提取30μg總蛋白后用12% SDS-PAGE膠分離，并轉至PVDF膜。隨后，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉PVDF膜1h。封閉結

13、束后，在搖床上與一抗4℃孵育過夜。孵育結束后，已經結合一抗的PVDF膜用TBST溶液漂洗3次，接著與辣根過氧化酶偶聯的二抗溶液孵育1h，實驗采用增強化學發(fā)光法。Western blot結束后的圖像由Image station2000R系統(tǒng)（美國Kodak公司）成像，并用生產商提供的軟件進行分析。 結果：我們在前期動物模型成功的基礎上，采用大鼠脾臟（最大的外周淋巴器官），分離出了高濃度、高質量的淋巴細胞。大鼠肝組織蛋白質的二維凝膠

14、電泳（2DE）圖像清晰，沒有背景條紋的干擾，蛋白質斑點分離完全，在相同條件下，反復3次重復的實驗結果圖大致相同，匹配率較高。以膠體考染的大鼠淋巴細胞蛋白質凝膠能獲得300余個清晰的蛋白質斑點，經過比較分析篩選出25個表達量具有顯著差異的蛋白質斑點，其中13個蛋白點表達水平上調，與對照組相比比值變化超過1.5倍以上，而12個蛋白點表達水平下調，其相應比值變化超過至少1.5倍以上。經過生物信息學分析得到與免疫相關蛋白得到6個。雙向凝膠電泳分

15、析發(fā)現的25個差異點中，有6個蛋白質參與細胞免疫反應。對其中已知部分功能免疫相關的10條基因進行分析，在表達上調的基因中，Y00480、AF084934、NM-013069及NM-013169是分別編碼主要組織相容性復合物（MHC）Ⅱ類分子α、β、γ多肽鏈（也稱恒定鏈或CL IP分子）和T淋巴細胞表面特異性抗原CD3分子δ多肽鏈的基因。靜息的T淋巴細胞表面僅表達MHCⅠ類抗原，活化的T淋巴細胞表面才表達MHCⅡ類抗原，MHCⅡ類相關基因

16、表達增加提示激活的T淋巴細胞明顯增加。CLIP分子占據MHCⅡ類分子的抗原結合溝，避免內源性抗原肽結合，外源性抗原肽與CLIP分子交換，結合于抗原結合溝，表達MHC2抗原肽復合體。MHCⅡ類分子和CD3表達增加印證了MHC2抗原肽復合體/T淋巴細胞受體2CD3復合體在T淋巴細胞早期活化中的重要作用。補體因子1在急性排斥反應中下調。補體因子1有降解補體C3b、C4b，抑制補體的作用，其基因（NM-024157）表達在急性排斥反應中下調，提

17、示除細胞免疫外，體液免疫也參與此過程。 小結：脾臟是機體最大的免疫器官，在機體的免疫應答過程中起到了重要的作用。在同種移植免疫排斥反應中，T淋巴細胞起著重要作用，參與了移植抗原的識別、免疫調節(jié)、溶細胞效應等多層次免疫應答。由于大鼠外周血內淋巴細胞含量極少，難以收集出高濃度及重量的淋巴細胞。因此我們采用大鼠脾臟，可提取符合實驗要求的淋巴細胞以備下一步實驗待用。雙向凝膠電泳與質譜技術的聯用是研究器官移植的有效手段。本文的實驗結果可以