RNA干擾CⅡTA控制大鼠肝移植急性排斥反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建針對(duì)大鼠Ⅱ類主要組織相容性復(fù)合物反式轉(zhuǎn)錄激活因子 (classⅡ major histocompability complex transactivator，CⅡTA)基因的短發(fā)夾狀RNA(small hairpin RNA，shRNA) 質(zhì)粒載體，通過體外轉(zhuǎn)染大鼠骨髓源樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)和體內(nèi)轉(zhuǎn)染脾臟的方法，研究RNA干擾C ⅡTA對(duì)于Ⅱ類主要組織相容性復(fù)合物(class Ⅱ major his

2、tocompability complex，MHc-Ⅱ)基因表達(dá)的抑制效果，并篩選相對(duì)高效 shRNA 質(zhì)粒；采用經(jīng)門靜脈注射質(zhì)粒載體的方法體內(nèi)轉(zhuǎn)染肝臟研究基因轉(zhuǎn)染效果；建立穩(wěn)定的高應(yīng)答大鼠原位肝移植模型，采用門靜脈注射質(zhì)粒載體方法干預(yù)供體，獲得免疫原性減低的移植物用于肝移植，研究RNA干擾CⅡTA在高應(yīng)答大鼠原位肝移植模型中控制移植排斥反應(yīng)的作用并探討其機(jī)制。 第一部分 CⅡTA-shRNA 質(zhì)粒載體構(gòu)建及體外研究 目

3、的：構(gòu)建針對(duì)大鼠CⅡTA基因的shRNA質(zhì)粒載體，探討體外RNA干擾CⅡTA 的抑制效果和對(duì)于MHC-Ⅱ基因表達(dá)的調(diào)控作用，并篩選相對(duì)高效shRNA質(zhì)粒。 方法：體外培養(yǎng)大鼠骨髓源 DC，構(gòu)建針對(duì)大鼠 C ⅡTA 基因的三個(gè)shRNA質(zhì)粒載體，設(shè)置空白對(duì)照組、HK-shRNA 陰性質(zhì)粒對(duì)照組、轉(zhuǎn)染劑 Lipofectamine組和三個(gè) CⅡTA-shRNA 質(zhì)粒干預(yù)組，分別轉(zhuǎn)染DC，以熒光實(shí)時(shí)定量PCR和流式細(xì)胞術(shù)檢測DC轉(zhuǎn)染后

4、CⅡTA 和 MHCⅡ的表達(dá)變化。 結(jié)果：大鼠骨髓源 DC培養(yǎng)成功，CⅡTA-shRNA 質(zhì)粒載體構(gòu)建成功：與空白對(duì)照組、HK-shRNA 陰性質(zhì)粒對(duì)照組和Lipofectamine組相比，三個(gè)CⅡTA-shRNA 質(zhì)粒干預(yù)組DC轉(zhuǎn)染后的CⅡTA和MHC-Ⅱ的mRNA轉(zhuǎn)錄水平及MHC-Ⅱ抗原表達(dá)水平均顯著性減低(P<0.01)，CⅡTA與MHC-Ⅱ基因表達(dá)具有明顯正相關(guān)；pCⅡTA1-shRNA干預(yù)組對(duì)目的基因表達(dá)抑制最為明顯，

5、CⅡTAmRNA 轉(zhuǎn)錄水平為 10.75±3.31％，MHC-ⅡmRNA 轉(zhuǎn)錄水平為15.25±5.73％，MHC-Ⅱ抗原表達(dá)水平為25.01±5.16％。 結(jié)論：應(yīng)用成功構(gòu)建的CⅡTA-shRNA 質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染大鼠骨髓源 Dc，可顯著抑制 DC 的CⅡTA 和 MHC-Ⅱ基因表達(dá)；CⅡTA 與 MHC-Ⅱ的基因表達(dá)具有明顯正相關(guān)，說明 CⅡTA嚴(yán)格調(diào)控 MHC-Ⅱ表達(dá)，RNA 干擾 CⅡTA可明顯抑制MHC-Ⅱ基因表達(dá)：pCⅡ

6、TA1-shRNA為相對(duì)高效的 shRNA 質(zhì)粒，可進(jìn)一步應(yīng)用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。 第二部分經(jīng)門靜脈注射質(zhì)粒載體的體內(nèi)研究 目的：評(píng)價(jià)經(jīng)門靜脈注射質(zhì)粒載體方法體內(nèi)轉(zhuǎn)染肝臟的轉(zhuǎn)染效果，探討體內(nèi)RNA 干擾 CⅡTA 的抑制效果和對(duì)于 MHC-Ⅱ基因表達(dá)的調(diào)控作用，并篩選相對(duì)高效shRNA質(zhì)粒。 方法：設(shè)置生理鹽水對(duì)照組和質(zhì)粒載體組，經(jīng)門靜脈注射方法體內(nèi)干預(yù)大鼠肝臟，采取轉(zhuǎn)染后第一天和第三天肝臟標(biāo)本，應(yīng)用全波長酶標(biāo)

7、儀檢測和熒光顯微鏡觀察的方法評(píng)價(jià)體內(nèi)肝臟轉(zhuǎn)染效果；設(shè)置生理鹽水對(duì)照組、HK-shRNA 陰性質(zhì)粒對(duì)照組和三個(gè)CⅡTA-shRNA 質(zhì)粒干預(yù)組，通過經(jīng)門靜脈注射方法體內(nèi)干預(yù)大鼠脾臟，轉(zhuǎn)染3天后取脾臟標(biāo)本，以熒光實(shí)時(shí)定量PCR和流式細(xì)胞術(shù)檢測脾臟轉(zhuǎn)染后 CⅡTA 和 MHC-Ⅱ的表達(dá)變化。 結(jié)果：第一天和第三天質(zhì)粒載體組的增強(qiáng)型綠熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)熒光強(qiáng)度均顯著

8、強(qiáng)于鹽水對(duì)照組(P<0.01)，質(zhì)粒載體組第三天熒光強(qiáng)度強(qiáng)于第一天(P<0.01)；與鹽水對(duì)照組和HK-shRNA陰性質(zhì)粒對(duì)照組相比，三個(gè)CⅡTA-shRNA 質(zhì)粒干預(yù)組脾臟轉(zhuǎn)染后的CⅡTA 和MHC-Ⅱ的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平及 MHC-Ⅱ的抗原表達(dá)水平均顯著性減低(P<0.01)，CⅡTA與MHC-Ⅱ基因表達(dá)具有明顯正相關(guān)；pCⅡTA1-shRNA干預(yù)組對(duì)目的基因表達(dá)抑制最為明顯，CⅡTA mRNA 轉(zhuǎn)錄水平為 9.244-1.12％，

9、MHC-Ⅱ mRNA轉(zhuǎn)錄水平為17.81±3.61％，MHC-Ⅱ抗原表達(dá)水平為23.874-5.45％。 結(jié)論：經(jīng)門靜脈注射質(zhì)粒載體方法可使shRNA質(zhì)粒在體內(nèi)肝臟獲得高效轉(zhuǎn)染；應(yīng)用成功構(gòu)建的CIIFA-shRNA 質(zhì)粒載體體內(nèi)轉(zhuǎn)染大鼠脾臟，可顯著抑制脾臟的CⅡTA和MHC-Ⅱ基因表達(dá)，CⅡTA與MHC-Ⅱ基因表達(dá)具有明顯正相關(guān)，說明CⅡTA嚴(yán)格調(diào)控MHC-Ⅱ表達(dá)，在體內(nèi)采用RNA干擾技術(shù)抑制CⅡTA可明顯抑制MHC-Ⅱ基因表達(dá)

10、；pCⅡTA1-shRNA為相對(duì)高效的shRNA質(zhì)粒，可進(jìn)一步應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。 第三部分 RNA干擾CⅡTA 在高應(yīng)答大鼠原位肝移植模型中的實(shí)驗(yàn)研究 目的：觀察經(jīng)門靜脈注射CⅡTA-shRNA質(zhì)粒方法干預(yù)供體移植物對(duì)高應(yīng)答大鼠原位肝移植模型中移植排斥反應(yīng)的影響，探討其抗排斥機(jī)制。 方法；建立高應(yīng)答大鼠原位肝移植模型；采用經(jīng)門靜脈注射pCⅡTA1-shRNA 方法干預(yù)供體大鼠肝臟，干預(yù)后3天取移植物進(jìn)行肝移植，同時(shí)

11、設(shè)置鹽水對(duì)照組、HK-shRNA 陰性質(zhì)粒對(duì)照組和環(huán)孢素A治療組，每組各12只大鼠，于移植術(shù)后第4天隨機(jī)選取6只大鼠取出移植肝臟，病理學(xué)檢查評(píng)定排斥反應(yīng)分級(jí)，熒光實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測標(biāo)本中CⅡTA、MHC-Ⅱ、IL-2和IFN-γ的mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化，免疫組化方法檢測MHC-Ⅱ抗原表達(dá)變化，其余6只用于觀察存活期。 結(jié)果：穩(wěn)定建立高應(yīng)答大鼠原位肝移植模型；與鹽水對(duì)照組和HK-shRNA陰性質(zhì)粒對(duì)照組相比，CⅡTA1-shRN

12、A 質(zhì)粒干預(yù)組大鼠存活時(shí)間明顯延長(中位生存期8天vs5天和5天，P<0.01)，排斥反應(yīng)病理分級(jí)明顯降低(P<0.01)，CⅡTA、MHC-Ⅱ、IL-2和IFN-γ的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平均明顯降低(P<0.01)，MHC-Ⅱ抗原表達(dá)水平明顯降低 (P<0.01)。環(huán)孢素A治療組大鼠均獲得了長期存活(超過100天)。 結(jié)論：高應(yīng)答大鼠原位肝移植模型是研究肝移植排斥反應(yīng)的理想動(dòng)物模型；CⅡTA與MHC-Ⅱ基因的表達(dá)與肝移植排斥反應(yīng)病