PLGA微球緩釋rhIGF-1對粘附于純鈦表面2型糖尿病人牙槽骨成骨細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用.pdf

1、口腔種植學(xué)作為一門新興學(xué)科，近些年來一直受到人們的關(guān)注。種植牙被稱為“人類的第三副牙齒”，并成為目前最為理想的缺牙修復(fù)方式。但許多全身系統(tǒng)性疾病，例如：心血管疾病、糖尿病、骨代謝性疾病、出血性疾病、自身免疫性疾病等，它們經(jīng)常導(dǎo)致種植修復(fù)的最終失敗，極大地限制了種植技術(shù)的推廣。尤其隨著人們生活水平的提高、飲食結(jié)構(gòu)的改變，糖尿病特別是2型糖尿病患病人數(shù)呈逐年上升趨勢?；谶@一現(xiàn)狀，我們課題組進(jìn)行了前期的動物實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了種植失敗的主要原因是種

2、植體周圍不能形成良好的骨性結(jié)合，指出了成骨細(xì)胞的形成與分化是影響骨結(jié)合的關(guān)鍵所在，所以我們很有必要對2型糖尿病患者的牙槽骨成骨細(xì)胞的生物學(xué)特性從細(xì)胞生物學(xué)角度進(jìn)行初步研究，用具有理想控釋系統(tǒng)的微球局部持續(xù)釋放多肽性生長因子進(jìn)行干擾，分析其對成骨細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用，為下一步臨床就如何提高2型糖尿病患者種植牙成功率這一棘手問題提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　研究內(nèi)容和目的：
　　臨床中，采集接受口腔種植的2型糖尿病患者和正常患者牙槽骨

3、剩余骨碎屑，分別進(jìn)行體外培養(yǎng)，分析生物學(xué)特性，進(jìn)行對比研究，證實(shí)2型糖尿病患者牙槽骨成骨細(xì)胞的生物學(xué)活性較正常人差，為后續(xù)研究提供實(shí)驗(yàn)載體。
　　利用具有良好生物相容性、可降解性，且無毒副作用的生物聚合物PLGA，采用水/油/水（W/O/W）雙層乳液法，包裹多肽性生長因子rhIGF-1，制備成具有持續(xù)釋放能力的緩釋微球，對微球的大小、形態(tài)作掃描電鏡（SEM）觀察，并作體外釋放動力學(xué)實(shí)驗(yàn)，繪制其曲線，分析微球的持續(xù)釋放能力。

4、　　在同一細(xì)胞計數(shù)的情況下，PLGA包裹的rhIGF-1和安慰劑兩種微球分別加入兩組載有鈦片的2型糖尿病患者牙槽骨成骨細(xì)胞的培養(yǎng)皿中，利用rhIGF-1的持續(xù)釋放作用分析對其成骨細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用，為下一步臨床應(yīng)用研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，從而也為解決2型糖尿病患者種植牙失敗率高這一棘手問題進(jìn)行有效探索。
　　實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果：
　　第一部分：
　　方法：無菌條件下，收集3組接受口腔種植的2型糖尿病患者和正常患者牙槽骨剩余骨碎屑

5、，采用組織塊法進(jìn)行體外培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)，取第四代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究，堿性磷酸酶（ALP）化學(xué)染色法檢測成骨細(xì)胞的活性，茜素紅（Alizarinred）染色法進(jìn)行細(xì)胞成骨特性的檢測，噻唑藍(lán)（MTT）比色法檢測兩種細(xì)胞的增值趨勢，酶動力學(xué)的方法作堿性磷酸酶（ALP）活性定量測定，放射免疫的方法測定骨鈣素（BGP）的濃度，酶聯(lián)免疫分析（ELISA）的方法進(jìn)行細(xì)胞上清液中Ⅰ型膠原（COL-Ⅰ）濃度的檢測。
　　結(jié)果：
　

6、?。?）同等培養(yǎng)條件下，二者的形態(tài)無明顯差異，但2型糖尿病牙槽骨成骨細(xì)胞較正常人細(xì)胞生長慢、活性弱及礦化結(jié)節(jié)形成少；2型糖尿病成骨細(xì)胞上清液中ALP、BGP及COL-Ⅰ含量均較對照組低（P﹤0.05）。
　?。?）2型糖尿病人的成骨細(xì)胞在含低糖的DMEM培養(yǎng)基中生長緩慢，在其高糖培養(yǎng)基中卻生長較快，而正常成骨細(xì)胞則在低糖或高糖培養(yǎng)基中差異不明顯。
　　第二部分：
　　方法：以rhIGF-1加蒸餾水形成W1相，Span8

7、0和PLGA作為O相，二相結(jié)合形成W1/O初乳液，最后與W2相（tween80和PVA組成）形成W1/O/W2雙層乳液，蒸發(fā)溶劑后形成所需微球。對微球作掃描電鏡分析，觀察其大小、形態(tài)以及質(zhì)地是否均勻。通過累積釋放率繪制釋放動力學(xué)曲線，以觀察微球的持續(xù)釋放效能。
　　結(jié)果：
　　（1）實(shí)驗(yàn)所獲微球的表面形態(tài)較光滑，大小較均勻。微球粒徑約為1.4076±0.5238μm。包封率約為82.3±1.8％。
　　（2）從繪制的釋

8、放動力學(xué)曲線可以看出，所得到的微球具有良好的釋放能力，開始時釋放較快，前20天累積釋放率約為84％，以后逐漸減慢，大約40天釋放完畢。
　　第三部分：
　　方法：在培養(yǎng)孔中放入鈦片，加入細(xì)胞懸液，培養(yǎng)一定時間后，取出鈦片，進(jìn)行細(xì)胞非特異性熒光染色，證實(shí)兩種細(xì)胞與鈦片的貼附。在同一細(xì)胞計數(shù)的情況下，6孔培養(yǎng)板中，每孔均勻放置8枚鈦片，細(xì)胞長滿后，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，分析培養(yǎng)皿中兩種細(xì)胞與鈦片的結(jié)合能力。同樣方式，把rhIGF-1微球

9、和PLGA包裹的安慰劑微球分別加入兩組載有鈦片的2型糖尿病人牙槽骨成骨細(xì)胞的培養(yǎng)皿中（因放入8枚鈦片過于擁擠，不利于細(xì)胞的觀察和換液，改置每孔放入5枚鈦片），細(xì)胞爬滿后計數(shù)，證實(shí)rhIGF-1微球?qū)︹伷霞?xì)胞的誘導(dǎo)作用。
　　結(jié)果：
　　（1）非特異性熒光染色顯示兩種細(xì)胞均勻地貼附在鈦片上，可清楚地觀察到細(xì)胞核和細(xì)胞膜。
　?。?）經(jīng)細(xì)胞計數(shù)，可以計算出兩種細(xì)胞與鈦片的貼附數(shù)量，2型糖尿病人牙槽骨成骨細(xì)胞較正常人少，二

10、者有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.05）。
　?。?）2型糖尿病人牙槽骨成骨細(xì)胞加入兩種微球后，經(jīng)細(xì)胞計數(shù)，加入rhIGF-1微球的糖尿病人成骨細(xì)胞數(shù)較加入安慰劑微球的糖尿病人成骨細(xì)胞數(shù)多，二者存在統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.05），證實(shí)了PLGA包裹的rhIGF-1微球?qū)?型糖尿病人牙槽骨成骨細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用。
　　研究結(jié)論：
　?。?）2型糖尿病病人牙槽骨成骨細(xì)胞可以在體外成功培養(yǎng)，雖有正常成骨細(xì)胞的形態(tài)和生物學(xué)特性，但細(xì)胞生長緩