鈦表面HA-CS-TGF-β1緩釋微球復合涂層及其對成骨細胞粘附與增殖的影響.pdf

1、目的:本實驗擬采用物理-生物-化學聯(lián)合的方式，研究于純鈦表面制備HA/CS-TGF-β1緩釋微球復合涂層的方法，使鈦經表面改性后能具有有利于骨結合的理化形貌以及生化修飾，使之獲得相應的生物功能。探討HA/CS-TGF-β1緩釋微球復合涂層對大鼠成骨細胞早期粘附與增殖的作用，評價其細胞毒性及其對鈦表面成骨細胞特征基因表達的影響，以此為利用表面改性來提高口腔種植體的生物功能和早期骨結合提供理論依據和實驗基礎，為促進HA/CS-TGF-β1緩

2、釋微球復合涂層種植體的臨床運用進行一定的實驗探索。
　　方法:通過物理-化學-生物改性聯(lián)合的方式來制備HA/CS-TGF-β1緩釋微球涂復合涂層。將10mm*10mm*1 mm鈦片打磨清洗并進行表面微弧氧化處理后放入多巴胺溶液浸泡18h，干燥。將已溶解的HA緩慢滴入CS凝膠，攪拌溶解1.5h，在經上述步驟處理的干燥鈦片表面滴加該溶液，負壓處理10min，干燥24h。將經微弧氧化步驟處理的鈦片共100片平均分成A、B、C、D、E組，

3、每組20片，為實驗組。另備20片只經打磨處理的鈦片為對照F組，備5只編號分別為A、B、C、D、E的裝有20ml0.1g/ml CS凝膠的燒杯，各加入0.4g明膠微球，攪拌20min后放入對應的鈦片各20片，冰浴下各加入0.08gEDC溶解后加入0.12gNHS，隨后立刻加TGF-β1蛋白，加入蛋白濃度分別為A組15ng/ml、B組30ng/ml/、C組60ng/ml/、D組75n/ml、E組250ng/ml。交聯(lián)反應12h，干燥。以SE

4、M、XRD、FT-IR分別檢測HA/CS-TGF-β1緩釋微球復合涂層的理化結構、生化組成并檢測其親水性，釋藥量。
　　采用CCK-8法，取雙抗滅菌后各組鈦片各5片平鋪于48孔培養(yǎng)板。分離大鼠成骨細胞并進行細胞的原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)，將傳代培養(yǎng)后的P2代細胞懸液按100μl/孔的濃度接種于各組，置于37℃、5％C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng);于實驗的1、3、7d分別將培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱中取出，每孔加CCK-8試劑溶液20ul，37℃下孵育2.5 h

5、后每孔取110ul液體到96孔板內，使用酶標儀在波長為450 nm的條件下檢測各孔OD值。將成骨細胞按1*103/孔細胞密度接種于各組材料表面，每孔100μ l細胞懸液，于6h和3天后分別對細胞核進行DAPI染色，將染色后的細胞置于倒置熒光顯微鏡下觀察細胞的增殖情況。
　　將大鼠成骨細胞在復合涂層的鈦片上培養(yǎng)1d，2d，3d，5d，7d后取樣，對大鼠成骨細胞mRNA進行提取，轉錄，擴增。分別取10μL成骨細胞特征基因ALP，Run

6、x2，TGF-β1的PCR反應產物，在2.0％的瓊脂糖凝膠中進行電泳得出成骨標志性基因ALP，Runx2，TGF-β1的條帶。
　　結果:成功制備HA/CS-TGF-β1緩釋微球復合涂層，掃描電子顯微鏡(SEM)見實驗組鈦片表面存在形狀較為規(guī)則的、其大小和間距基本相同的小微孔，載TGF-β1蛋白的明膠微球形狀為圓球型，粒徑較為均勻，表面可見蛋白吸附。XRD圖譜可以看到當鈦表面制備HA/CS-TGF-β1緩釋微球復合涂層后，基體鈦峰

7、幾乎被湮沒，2θ=31.7°，這與HA標準粉末衍射數據譜峰的(211)晶面的特征峰位置吻和。復合涂層制備完成后接觸角幾乎為零，即該復合涂層具有超親水性。HA-CS-TGF-β1體外釋藥情況:在釋藥初期HA/CS-TGF-β1復合涂層存在“突釋”效應，而后蛋白的釋放逐漸平緩，至蛋白釋放第7d釋放達(58.4±1.8)％，14d時TGF-β1蛋白釋放濃度達(80.1±1.9)％。
　　將各組鈦片與細胞分別培養(yǎng)1d，3d，7d后，實驗結

8、果發(fā)現(xiàn)在1d時各組之間的差異不明顯(P＞0.05)，隨著對大鼠成骨細胞培養(yǎng)時間的增加，在第3天時，實驗組和對照組的大鼠成骨細胞的數量均有較為明顯增長且實驗組大鼠成骨細胞密度大于對照組的大鼠成骨細胞密度(P＜0.05)，B、C兩實驗組的大鼠成骨細胞增殖數目大于其他各組。第7天，實驗組細胞增殖情況明顯優(yōu)于對照組(P＜0.05)，B、C組細胞增殖明顯大于其他組(P＜0.05)，E組大鼠成骨細胞密度小于其他實驗組(P＜0.05)。大鼠成骨細胞于

9、復合涂層的鈦片上生長無抑制，表明該涂層無細胞毒性。大鼠成骨細胞接種于實驗組和對照組鈦片，孵育6h及3d之后，經DAPI對成骨細胞胞核染色后，發(fā)現(xiàn):接種6h，實驗組與對照組的鈦片表面的大鼠成骨細胞數量并無明顯差距;而在3d，各組均有明顯增殖，特別是實驗B、C組尤其明顯，E組的細胞數量少于其他實驗組的大鼠成骨細胞數量，所有實驗組的細胞數量明顯比對照組多，實驗結果證實了復合涂層可促進成骨細胞的粘附與早期增殖。
　　在一定TGF-β1濃度

10、下鈦表面成骨細胞的ALP，Runx2基因表達量將隨著時間增加，B、C兩組尤為明顯，而TGF-β1的表達量基本不變。
　　結論:
　　(1) HA/CS-TGF-β1緩釋微球復合涂層釋藥穩(wěn)定且維持時間長，能較長時間的為組織提供TGF-β1。
　　(2) HA/CS-TGF-β1緩釋微球復合涂層完成后接觸角幾乎為零，即具有超親水性。由細胞的粘附與增殖實驗可以看出，親水性的樣品表面確實對相應的細胞的粘附與增殖有促進作用。