一個Axenfeld-Rieger綜合征患者致病基因突變檢測與功能研究.pdf

1、Axenfeld-Rieger綜合征(ARS)是一種罕見的常染色體顯性遺傳病,發(fā)病率為1:200000。其主要臨床癥狀為眼前段、顱面部、臍和牙齒等發(fā)育異常,約50％的病人會發(fā)展為青光眼,部分患者還伴隨垂體功能異常、中耳耳聾、心臟缺陷、尿道下裂、生長遲緩和智力低下等癥狀。目前,已發(fā)現(xiàn)兩個ARS的致病基因PITX2和FOXC1,分別位于染色體4q25和6p25區(qū)域。此外還有一個致病位點位于染色體13q14區(qū)域,尚未發(fā)現(xiàn)致病基因。
　　

2、我們收集并鑒定了一名ARS患者,該患者眼睛發(fā)育異常、雙目有翳,視力低下,畏光;牙齒缺失,所見為義齒;指(趾)甲大小正常,但未見繼續(xù)生長;肚臍向外突出。首先對 PITX2基因的所有外顯子及外顯子和內含子交界處進行直接測序,將測到的序列與正常的PITX2基因序列比對,發(fā)現(xiàn)患者PITX2基因4號內含子的-11位有一個A到 G的堿基改變,即 IVS4-11A>G。對患者的母親、小姨和同母異父弟弟的PITX2基因進行測序,結果顯示他們并不攜帶這一

3、改變?；颊吒副硇鸵舱?我們推測患者攜帶的IVS4-11A>G可能是一個新發(fā)改變。生物信息學預測該改變可能產生一個新的剪切受體位點。該基因在外周血中表達量很低,為了驗證 IVS4-11A>G改變是否影響剪切,我們從患者和正常人的基因組中分別構建了包含堿基改變位點的微小基因載體,分別轉染Hela細胞,并進行RT-PCR和測序分析,結果發(fā)現(xiàn)該堿基改變導致剪接方式的改變,即RT-PCR產物引入4號內含子3’端的10個堿基,導致PITX2在13

4、1位氨基酸處發(fā)生移碼,產生一個預測包含246個氨基酸的新蛋白(突變的PITX2)。預測該突變的PITX2缺失部分同源結構域(homeodomain, HD)和全部的OAR(otp aristaless and rax)結構域,打亂了PITX2的核定位信號(nuclear localization signal, NLS),影響PITX2的細胞核定位。為了檢驗該突變體的功能,我們構建野生型和突變型PITX2-pEGFP-C1載體,轉染He

5、la細胞并用共聚焦顯微鏡觀察,發(fā)現(xiàn)突變蛋白的亞細胞定位確實發(fā)生了改變。與正常蛋白全部定位于細胞核內不同,突變蛋白主要分布在細胞質中,且定位于細胞質中的蛋白分布不均勻,有明顯的點狀聚集。并且突變蛋白絕大部分與內質網共定位,僅有少部分與高爾基體共定位。
　　PITX2在脊椎動物的心臟、肺、大腦、牙齒和垂體中廣泛表達,它參與Nodal-Shh通路和Wnt-Frizzled-β-catenin通路,在胚胎發(fā)育早期起重要的調控作用。參與調控

6、眼前段發(fā)育的DKK2基因和參與調控牙齒發(fā)育的DLX2基因等都是PITX2的下游靶基因。IVS4-11A>G突變導致PITX2缺失部分HD結構域和全部的OAR結構域,可能喪失特異性結合DNA以及轉錄激活的能力,并且導致部分突變蛋白不能進入細胞核內,這都將使PITX2無法發(fā)揮轉錄激活下游靶基因的能力,不能正常調控眼前段和牙齒的發(fā)育,從而導致ARS的發(fā)生。總之,本研究通過分子遺傳學和分子生物學等手段,確定了一個ARS患者的致病基因和突變,并對