人膠質(zhì)瘤TERT基因啟動(dòng)子突變分析和致病機(jī)制研究以及一個(gè)Alport綜合征家系的基因突變分析.pdf

1、本文主要從以下幾部分論述：
　　論文一 人膠質(zhì)瘤TERT基因啟動(dòng)子突變分析及致病機(jī)制研究
　　目的：
　　本研究對(duì)101例膠質(zhì)瘤標(biāo)本，49例其他顱內(nèi)腫瘤標(biāo)本和5種膠質(zhì)瘤細(xì)胞系進(jìn)行TERT基因啟動(dòng)子區(qū)突變分析，并檢測(cè)野生及突變型腫瘤組織中TERT的mRNA表達(dá);結(jié)合患者的臨床、病理資料及隨訪信息等進(jìn)行相關(guān)的統(tǒng)計(jì)分析并繪制生存曲線。為進(jìn)一步證實(shí)TERT啟動(dòng)子突變作用的分子機(jī)制，我們利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，證明突變型TE

2、RT啟動(dòng)子活性顯著高于野生型。最后我們模擬腫瘤微環(huán)境改變，證實(shí)在低氧環(huán)境/化療藥物作用下，突變型啟動(dòng)子仍能夠維持較高轉(zhuǎn)錄活性。
　　材料方法：
　　一、膠質(zhì)瘤中TERT基因啟動(dòng)子區(qū)突變篩查
　　提取101例膠質(zhì)瘤組織及5種膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的基因組DNA。此外還提取了49例其他顱內(nèi)腫瘤，包括22例腦膜瘤，17例垂體瘤，6例顱內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤和4例海綿狀血管瘤，以及2例正常腦組織的基因組DNA。PCR擴(kuò)增TERT核心啟動(dòng)子區(qū)，進(jìn)行Sa

3、nger測(cè)序分析。
　　二、膠質(zhì)瘤中TERT mRNA表達(dá)水平檢測(cè)
　　提取6例TERT啟動(dòng)子突變型，2例TERT啟動(dòng)子野生型膠質(zhì)瘤組織及2例正常腦組織中總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，比較野生型及突變型膠質(zhì)瘤組織中TERT的mRNA表達(dá)情況。
　　三、結(jié)合膠質(zhì)瘤患者臨床及病理資料，根據(jù)TERT啟動(dòng)子突變狀態(tài)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析
　　針對(duì)患者的性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤累及范圍、腫瘤大小、術(shù)前KPS評(píng)分、手術(shù)切

4、除方式及病理級(jí)別進(jìn)行分類，結(jié)合TERT啟動(dòng)子突變狀態(tài)，采用t檢驗(yàn)分析不同指標(biāo)的平均值，x2檢驗(yàn)用于比較不同變量的構(gòu)成比;利用Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸模型對(duì)不同亞型膠質(zhì)瘤患者進(jìn)行生存分析。
　　四、雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)TERT啟動(dòng)子區(qū)突變對(duì)其轉(zhuǎn)錄活性的影響
　　構(gòu)建包含TERT基因核心啟動(dòng)子的螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的U87細(xì)胞，24小時(shí)后進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè)。
　　五、腫瘤微環(huán)境改變對(duì)TETR突變型啟動(dòng)

5、子轉(zhuǎn)錄活性的影響
　　應(yīng)用體外雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，對(duì)體外培養(yǎng)的U87細(xì)胞，進(jìn)行CoCl2刺激模擬腫瘤細(xì)胞缺氧或直接置于1％O2的低氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)，以及加入化療藥物替莫唑胺作用，24小時(shí)后進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè)。
　　結(jié)果：
　　一、膠質(zhì)瘤組織及細(xì)胞系中均存在TERT啟動(dòng)子的高頻突變
　　Sanger測(cè)序分析結(jié)果表明膠質(zhì)瘤中存在TERT啟動(dòng)子的高頻突變，在101例膠質(zhì)瘤組織中，發(fā)現(xiàn)45例(44.6％)存在T

6、ERT啟動(dòng)子突變，-124C＞T突變33例，-146C＞T突變12例。在5種膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中，均存在TERT基因啟動(dòng)區(qū)不同位點(diǎn)的突變。在腦膜瘤，垂體腺瘤，海綿狀血管瘤，顱內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤和正常腦組織，以及對(duì)應(yīng)的患者的外周血基因組DNA中均未發(fā)現(xiàn)TERT啟動(dòng)子突變。
　　二、膠質(zhì)瘤中TERT啟動(dòng)子突變顯著增強(qiáng)其mRNA表達(dá)水平
　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，與正常腦組織相比，5例TERT突變型腫瘤組織中TERT表達(dá)均增高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

7、義(P＜0.05);在TERT野生型腫瘤組織中，未觀察到TERT mRNA表達(dá)的顯著增高。
　　三、膠質(zhì)瘤中TERT啟動(dòng)子突變與患者年齡及病理級(jí)別顯著相關(guān)
　　x2檢驗(yàn)結(jié)果表明TERT啟動(dòng)子突變狀態(tài)與患者年齡和病理級(jí)別顯著相關(guān)(P=0.004)，高年齡組TERT啟動(dòng)子突變率高于低年齡組，高級(jí)別膠質(zhì)瘤TERT突變頻率高于低級(jí)別膠質(zhì)瘤(P=0.039)。
　　四、高級(jí)別膠質(zhì)瘤及星形細(xì)胞瘤中TERT啟動(dòng)子突變型患者總體生存率

8、顯著低于野生型
　　應(yīng)用Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，對(duì)不同級(jí)別膠質(zhì)瘤進(jìn)行回歸分析，結(jié)果提示在高級(jí)別膠質(zhì)瘤及星形細(xì)胞瘤中，與TERT啟動(dòng)子野生型的患者相比，攜帶突變型TERT啟動(dòng)子患者總體生存率低，提示預(yù)后不良（P＜0.05）。
　　五、TERT基因啟動(dòng)子突變?cè)鰪?qiáng)自身轉(zhuǎn)錄活性
　　雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證明，TERT基因啟動(dòng)子區(qū)-124和-146位點(diǎn)突變后，TERT自身轉(zhuǎn)錄活性均顯著升高，且該過(guò)程依賴于Ets/TCF轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)

9、的轉(zhuǎn)錄激活。TERT啟動(dòng)子區(qū)-245位SNP rs2853669對(duì)突變所致的轉(zhuǎn)錄激活具有恢復(fù)作用。
　　六、腫瘤微環(huán)境改變條件下TERT突變型啟動(dòng)子仍能夠維持自身的高轉(zhuǎn)錄活性
　　在低氧及化療藥物TMZ作用下，突變型TERT啟動(dòng)子仍然維持顯著高于野生型的轉(zhuǎn)錄活性。
　　結(jié)論：
　　1、膠質(zhì)瘤中存在TERT啟動(dòng)子區(qū)的高頻率突變。
　　2、TERT啟動(dòng)子突變型膠質(zhì)瘤組織中TERT mRNA表達(dá)水平顯著升高。

10、r>　　3、TERT啟動(dòng)子-124及-146位點(diǎn)突變導(dǎo)致Ets/TCF依賴的自身轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)。
　　4、膠質(zhì)瘤中TERT啟動(dòng)子突變與患者年齡及病理級(jí)別顯著相關(guān)。
　　5、在高級(jí)別膠質(zhì)瘤及星形細(xì)胞瘤中，TERT啟動(dòng)子突變型患者總體生存率下降，提示預(yù)后不良。
　　6、在腫瘤微環(huán)境改變時(shí)，即缺氧及化療藥物TMZ作用下，突變型TERT啟動(dòng)子仍能夠保持高轉(zhuǎn)錄活性。
　　論文二 一個(gè)Alport綜合征家系的基因突變分析

11、>　　目的：
　　本研究目的在于利用新一代測(cè)序技術(shù)鑒定一個(gè)中國(guó)X連鎖AS家系中的基因突變，輔助臨床診斷，提供準(zhǔn)確的遺傳咨詢，并為產(chǎn)前診斷提供依據(jù)。
　　方法：
　　一、家系資料
　　對(duì)家系中可能追溯到的家庭成員進(jìn)行詳細(xì)調(diào)查，記錄患者臨床癥狀及檢查結(jié)果并繪制系譜圖，抽取患者及家系成員外周靜脈血。
　　二、基因組DNA提取及定量
　　采用QIAgen外周血中量提取試劑盒提取基因組DNA，并使用高精度熒光計(jì)

12、進(jìn)行基因組DNA定量，用于下一步的高通量測(cè)序。
　　三、新一代高通量測(cè)序
　　1.利用Ion torrent的PGM測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行新一代半導(dǎo)體測(cè)序。首先進(jìn)行文庫(kù)制備，然后連接Adapter和Barcode，DNA片段純化，洗脫以及文庫(kù)擴(kuò)增，文庫(kù)質(zhì)量評(píng)估，模板制備與富集，芯片上樣，上機(jī)測(cè)序。
　　2.所得數(shù)據(jù)經(jīng)Ion Torrent Suite3.2軟件初步分析和dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)過(guò)濾得到檢出的變異。
　　3.通過(guò)In

13、tegrative Genomics Viewer(IGV)軟件可視化查看靶向區(qū)域內(nèi)每個(gè)堿基的測(cè)序情況，排除假陽(yáng)性結(jié)果和panel覆蓋不全區(qū)域的假陰性結(jié)果。
　　四、Sanger測(cè)序驗(yàn)證及RFLP分析
　　通過(guò)數(shù)據(jù)分析及IGV軟件檢查，排除假陽(yáng)性結(jié)果，對(duì)所獲得的變異位點(diǎn)及panel覆蓋不好的區(qū)域，設(shè)計(jì)PCR引物進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證。針對(duì)新突變位點(diǎn)，利用RFLP方法驗(yàn)證其在正常人群的頻率。
　　五、cDNA分析

14、>　　提取家系成員新鮮外周血總RNA，反轉(zhuǎn)錄為eDNA。設(shè)計(jì)涵蓋突變位點(diǎn)的cDNA引物，PCR擴(kuò)增后進(jìn)行電泳檢測(cè)，并進(jìn)行Sanger測(cè)序及克隆測(cè)序分析。
　　結(jié)果：
　　一、患者臨床表現(xiàn)及家系分析
　　先證者男性，首次發(fā)病年齡7歲，肉眼血尿，進(jìn)行性蛋白尿和高血壓，25歲時(shí)發(fā)展為終末期腎病，接受腎移植治療。家系中主要為男性發(fā)病，女性雜合子個(gè)體有輕微鏡下血尿或無(wú)任何癥狀，符合X連鎖顯性遺傳方式。
　　二、新一代高通量

15、測(cè)序結(jié)果
　　高通量測(cè)序共產(chǎn)生數(shù)據(jù)量855.8M，平均測(cè)序深度＞100×，覆蓋度＞98％，經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)分析和dbSNP137數(shù)據(jù)庫(kù)過(guò)濾，未發(fā)現(xiàn)明確的致病突變。利用IGV軟件瀏覽，主要關(guān)注COL4A3，COL4A4和COL4A5基因，COL4A5基因中第10號(hào)外顯子未被覆蓋，外顯子4，17，20，21，37和45覆蓋不完全。
　　三、Sanger測(cè)序驗(yàn)證及RFLP結(jié)果
　　對(duì)以上未被遺傳病panel覆蓋或覆蓋不全的7個(gè)片段進(jìn)

16、行PCR擴(kuò)增和Sanger測(cè)序分析，結(jié)果顯示在先證者的內(nèi)含子9外顯子10邊界存在c.547-3C＞A的剪接突變，該突變?cè)诩蚁祪?nèi)共分離。選取140名無(wú)關(guān)對(duì)照個(gè)體，進(jìn)行RFLP分析，未發(fā)現(xiàn)正常個(gè)體中存在該突變位點(diǎn)。檢索人類基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)和千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，均未發(fā)現(xiàn)關(guān)于該突變位點(diǎn)的報(bào)道。
　　四、cDNA分析結(jié)果
　　RT-PCR結(jié)果顯示，與正常個(gè)體相比，先證者產(chǎn)生一個(gè)較短的異常轉(zhuǎn)錄本，先證者母親則包含了野生和異常的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本。P