Twist誘導上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)變在肝細胞癌血管生成中的作用.pdf

1、目的：研究肝細胞癌(HCC)中是否存在血管生成擬態(tài)(VM)，探討Twist誘導上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)在HCC血管生成中的作用，揭示HCC血管生成的可能分子機制。 方法：應用CD31和PAS雙重染色及Hepatocyte免疫組化染色方法檢測102例福爾馬林固定、石蠟包埋肝細胞癌組織中是否存在血管生成擬態(tài)；免疫組織化學方法檢測Twist、E-cadherin、β-catenin、Vimentin、MMP-9和MMP-2在有VM組與

2、無VM組HCC中的表達，通過CD31免疫組化染色計數(shù)微血管密度(MVD)。 結(jié)果：一、HCC中存在血管生成擬態(tài)：1.HE染色結(jié)果觀察到19例肝癌組織中存在由肝癌細胞圍成的管腔樣結(jié)構(gòu)，該管腔無內(nèi)皮細胞襯附，管腔內(nèi)可見紅細胞，而管腔周圍未見壞死的肝癌細胞，也未見到出血及炎細胞浸潤；還觀察到這種管腔樣結(jié)構(gòu)主要存在于分化差、惡性度高的實體型及低分化型的HCC中，提示這種結(jié)構(gòu)與HCC惡性生物學行為相關。2.CD31/PAS雙重染色及Hep

3、atocyte免疫組化染色結(jié)果CD31為內(nèi)皮細胞特異標記物，而Hepatocyte為肝癌細胞特異標記物，因此為了證實HE切片中觀察到的管腔樣結(jié)構(gòu)為血管生成擬態(tài)，本文進行了CD31與PAS雙重染色及Hepatocyte免疫組化染色。顯微鏡下觀察顯示：圍成管腔樣結(jié)構(gòu)的細胞Hepatocyte染色陽性、CD31染色陰性，證實為肝癌細胞而不是內(nèi)皮細胞，管腔內(nèi)存在紅細胞，一層PAS陽性物質(zhì)圍成環(huán)狀結(jié)構(gòu)將腫瘤細胞和紅細胞分開，管腔內(nèi)無壞死的腫瘤細胞

4、及炎細胞，提示該管腔樣結(jié)構(gòu)不是由于肝癌細胞壞死形成的裂隙，而是由肝癌細胞通過自身塑型圍成的類似血管的管道，而PAS陽性物質(zhì)圍成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)就類似血管的基底膜，也即表明這種管道為VM；二、Twist及其相關蛋白免疫組化結(jié)果：1.Twist蛋白在HCC中的表達Twist彌漫表達于肝癌細胞的胞漿內(nèi)，約有30％的病例陽性細胞聚集呈局部高表達，有的癌巢中呈局灶性強陽性表達：約有10％，尤其是低分化病例的肝癌細胞核內(nèi)也存在Twist的表達，提示Twi

5、st的定位與表達與肝癌細胞的分化程度密切相關。存在VM的HCC組Twist陽性表達率高，為78.95％(15/19)，陽性強度亦高，其陽性強度積分平均為2.94；而不存在VM的HCC組中Twist的陽性表達率為42.17％(35/83)，其陽性強度積分平均為2.62；兩組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示Twist作為一種轉(zhuǎn)錄因子在VM形成的信號轉(zhuǎn)導過程中可能起重要作用。2.上皮細胞粘附分子E-cadherin、β-caten

6、in在HCC中的表達E-cadherin主要表達于癌旁肝硬化組織的細胞膜上，呈現(xiàn)黃褐色顆粒狀著色，均勻分布。肝癌組織中E-cadherin表達降低甚至缺失。存在VM的HCC組E-cadherin的表達明顯降低，其陽性表達率為15.79％(3/19)，而不存在VM的HCC組E-cadherin的表達陽性率為48.19％(40/83)，兩者相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，推測肝癌細胞之間粘附力的減弱可能是VM形成的一個重要因素。3.

7、間葉標記蛋白Vimentin及基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9在HCG中的表達Vimentin陽性物質(zhì)分布于肝癌組織的間質(zhì)，主要位于腫瘤血管內(nèi)皮細胞，而肝癌細胞均為陰性表達。Vimentin常特異性地表達于間葉細胞，但是上皮源性腫瘤在演進過程中，也可“反?！北磉_，這種現(xiàn)象與腫瘤細胞的惡性生物學行為密切相關，提示肝癌細胞的惡性生物學行為可能與Vimentin的表達無關。4.相關分析結(jié)果：Twist表達與E-cadherin表達呈負相關

8、(r=-0.227，P<0.05)，而與MMP-9表達呈正相關(r=0.347，P<0.05)；三、Twist及其相關蛋白的表達與MVD的關系Twist高表達病例組MVD(20.48±13.52)大于低表達組(15.10±11.75)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；MMP-2高表達病例組MVD(18.42±12.01)大于低表達組(12.52±10.01)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；MMP-9高表達病例組MVD(20.0

9、8±13.36)大于低表達組(12.11±10.09)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；E-cadherin、β-catenin高表達組與低表達組之間MVD的差異沒有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示Twist、MMP-2和MMP-9可能促進HCC內(nèi)皮依賴性血管的形成；四、Twist及其相關蛋白的表達與HCC臨床病理參數(shù)的關系Twist、E-cadherin、β-catenin、MMP-2和MMP-9表達與HCC病人的年齡、性別、組織

10、學類型、腫瘤大小以及Edmondson分級均不相關。Twist、E-cadherin、MMP-2和MMP-9的表達與HCC的臨床分期及轉(zhuǎn)移有關。Twist在臨床分期為IIIIV期的肝癌組織中陽性率為60.71％(34/56)，與III期(陽性率為34.78％)相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；在轉(zhuǎn)移組的陽性率為75％(27/36)，而無轉(zhuǎn)移組的陽性率為34.85％(23/66)，兩組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。E-c

11、adherin在臨床分期為IIIIV期的陽性率為32.14％(18/56)，而在III期的陽性率54.35％(25/46)，兩組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。E-cadherin在轉(zhuǎn)移組與無轉(zhuǎn)移組的陽性率分別為27.78％(10/36)、50％(33/66)，兩組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。MMP-2和MMP-9在轉(zhuǎn)移組的陽性率分別為75％(27/36)、69.44％(25/36)，與無轉(zhuǎn)移組(陽性率分別為42.1

12、2％、43.89％)相比都具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明Twist的高表達、E-cadherin低表達可能加速了肝癌細胞的浸潤進展，MMP-2和MMP-9的高表達導致細胞外基質(zhì)和基底膜的降解加速，從而使肝癌細胞易于移出癌巢和進出血管，形成新的轉(zhuǎn)移灶。 結(jié)論：1)HCC中存在VM，VM是腫瘤細胞為適應環(huán)境而產(chǎn)生的一種獨特的血液供應模式，與內(nèi)皮依賴性血管并存于腫瘤組織內(nèi)，其發(fā)生率為18.6％(19/102)，存在VM的HCC惡

13、性度高，易轉(zhuǎn)移，預后差。2)存在VM的HCC組中Twist和MMP-9陽性表達率均高于不存在VM的HCC組，而存在VM的HCC組中E-cadherin陽性表達率低于不存在VM的HCC組；相關分析表明Twist陽性表達與E-cadherin呈負相關關系，而與MMP-9呈正相關關系，提示Twist可能通過抑制E-cadherin的表達，上調(diào)MMP-9的表達促進HCC中VM的形成。MMP-9表達上調(diào)降解并重塑細胞外基質(zhì)，為肝癌細胞形成VM創(chuàng)造

14、了條件。3)MVD在Twist、MMP-9及MMP-2高表達組均大于低表達組；相關分析表明Twist陽性表達與MMP-9呈正相關關系、而與MMP-2無相關關系，提示Twist可能主要通過上調(diào)MMP-9的表達促進HCC血管生成，MMP-9通過降解細胞外基質(zhì)和基底膜，促進HCC血管生成。4)Twist蛋白可能參與了HCC局部微循環(huán)的建立，其機制可能為Twist蛋白過表達誘導上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)變，使肝癌細胞E-cadherin表達下調(diào)，β-cate