體外誘導犬骨髓間充質干細胞定向肝細胞分化.pdf

1、BMSCs作為組織工程的種子細胞具有較多優(yōu)勢，BMSCs是成體干細胞，來自患者自身，取材方便，有多向分化潛能，而干細胞替代病態(tài)的肝細胞已成為肝臟導向的細胞治療的主要目標，對干細胞分化向肝細胞進行深入的研究，有望給肝病治療帶來新的飛躍。 目的：⑴. 建立犬BMSCs體外培養(yǎng)體系，觀察BMSCs的形態(tài)、生長特性及表面抗原的表達情況。⑵. 探討HGF、EGF對骨髓間充質干細胞向肝細胞方向的誘導分化作用，探索出適當?shù)恼T導條件，為進一步深

2、入研究和臨床應用提供基礎。 材料和方法：⑴. BMSCs的分離培養(yǎng)和生物學特性分析：采用全血貼壁法對BMSCs進行分離培養(yǎng)，觀察BMSCs的形態(tài)及生長特性。培養(yǎng)至第2代進行檢測：細胞活力分析，流式細胞技術檢測細胞表面抗原表達情況，MTT法繪制細胞生長曲線。⑵. BMSCs體外誘導分化為肝細胞及相關標志物檢測：細胞培養(yǎng)至第3代，依據(jù)培養(yǎng)液中所加生長因子不同分為四組：無生長因子組、EGF組、HGF組和HGF+EGF組，相應標記為A

3、、B、C、D四組，并于誘導后7d、14d、21d留取細胞，免疫組化檢測AFP、CK-18表達情況，免疫熒光檢測ALB表達，PAS反應檢測糖原，RT-PCR分析ALB mRNA表達情況。⑶. 流式細胞技術分析誘導細胞的分化率并對結果進行統(tǒng)計學分析。 結果：⑴. 細胞培養(yǎng)：接種7d后在倒置相差顯微鏡下觀察見原代BMSCs呈集落樣生長，傳代后細胞散在分布，大小形態(tài)均一性好，細胞增殖旺盛。至第2代臺盼藍染色細胞活力可達98％左右。分離

4、的細胞表面CD標記為：CD13－、CD34－、CD45－、CD29＋，均一性可達90％以上。MTT法繪制生長曲線可見第2代BMSCs有很強的增殖能力。⑵. 生物化學檢測：C、D組誘導培養(yǎng)細胞均可檢測到肝系細胞的標志，細胞誘導至7d時出現(xiàn)AFP表達，14d時表達增高，21d時表達下降；7d時可有少數(shù)細胞表達CK-18，14d時ALB和糖原出現(xiàn)表達，且CK-18、ALB和糖原隨著時間延長表達量逐漸增高；3周時RT-PCR也可檢測到ALB m

5、RNA的表達；A、B組細胞沒有檢測到肝系細胞標志。⑶. 統(tǒng)計學分析：21d時熒光標記誘導細胞ALB后流式細胞儀檢測細胞分化率，對各組誘導率進行單因素方差分析，結果表明：D組誘導率明顯高于C組（P<0.05）。 結論：⑴. 采用全血貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)的骨髓間充質干細胞增殖力旺盛，而且具有較高的活力和純度。⑵. HGF和EGF體外可以誘導BMSCs定向肝細胞樣細胞分化，而且二者有協(xié)同作用。⑶. 單獨EGF無誘導BMSCs定向肝細胞