人骨髓間充質(zhì)干細胞向血管內(nèi)皮細胞誘導的研究.pdf

1、瓣膜病在先天性心臟病的患兒中占有一定的比例,瓣膜置換術(shù)是此類疾病的最終治療辦法?，F(xiàn)今用于臨床的瓣膜置換物有機械瓣和同種異體瓣膜兩大類。雖然此兩種瓣膜在臨床研究上已經(jīng)取得了長足的進展,但仍有很多問題限制了兩者在臨床的長期應用。因此,對心臟瓣膜的組織工程學研究是心臟外科領域的重大課題。
　　 組織工程心臟瓣膜主要包括種子細胞的選擇、瓣膜支架的制備、體外的聯(lián)合培養(yǎng)以及在臨床上應用的研究。種子細胞的選擇是瓣膜組織工程的首要問題,也是研究

2、的熱點。以往的研究主要集中在自體血管的壁細胞和內(nèi)皮祖細胞,由于各自的缺陷,限制了其在研究中的應用。如今研究較多的是各種干細胞的誘導分化,例如胚胎干細胞和骨髓干細胞的誘導分化；而骨髓干細胞以其容易獲取、多向分化、增殖迅速等優(yōu)點成為了當今種子細胞研究的熱點。
　　 本研究利用人的骨髓血,采用密度梯度離心法獲取骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs),經(jīng)過貼壁培養(yǎng)和傳代,獲取純化的BMSCs。而后,在含有內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)和堿性成纖維

3、細胞生長因子(Bfgf)的DMEM培養(yǎng)基中進行誘導分化,使BMSCs向血管內(nèi)皮細胞的方向分化。通過形態(tài)學觀察和細胞生長曲線的繪制來觀察細胞生長狀態(tài),免疫細胞化學染色和流式細胞術(shù)檢測內(nèi)皮細胞特有的表面標記抗原CD31、CD34和Ⅷ因子。通過本實驗可以說明骨髓干細胞具有向內(nèi)皮細胞分化的潛能,為其應用于組織工程心臟瓣膜提供依據(jù)。
　　 材料和方法：
　　 1研究對象
　　 骨髓血標本來源于臨床心臟外科住院手術(shù)病人,無骨

4、髓造血性疾病,半年內(nèi)未進行過放療或化療。
　　 2實驗方法
　　 2.1骨髓血采集:
　　 在病人家屬及病人知情同意后,手術(shù)室內(nèi)取右側(cè)骼前上棘為穿刺點,消毒鋪巾后,行骨髓穿刺術(shù),抽取骨髓血5ml。注射器預先用2ml濃肝素鈉濕潤,以便抗凝。在低溫下轉(zhuǎn)運至實驗室,以保持細胞活力。并注意無菌操作以避免污染。
　　 2.2標本制備:
　　 在無菌的條件下,利用密度梯度法對細胞進行分離培養(yǎng)。之后接種于25m

5、l的培養(yǎng)瓶中,3天之后首次換液.直到細胞生長至鋪滿整個瓶底的80％-90％時進行第一次傳代,以1:2-1:3的比例接種于培養(yǎng)瓶中。待細胞傳代至第3代時,用含有VEGF、Bfgf的培養(yǎng)基進行誘導分化,換液時間和方法同前。在不同的時間對細胞的生長狀態(tài)進行觀察,記錄細胞形態(tài)的變化、繪制細胞生長曲線。
　　 2.3實驗測定:
　　 細胞誘導后大約20天時進行免疫細胞化學染色和流式細胞術(shù)檢測,檢測內(nèi)容為CD31、CD34、Ⅷ因子(

6、內(nèi)皮細胞特征性標記抗原)。
　　 結(jié)果：
　　 1接種初期BMSCs形態(tài)是短梭形的,等細胞生長一定的天數(shù)之后,細胞逐漸的增大成長梭形或者是紡錘形。原代的細胞生長成巢狀或者是旋渦狀,而傳代之后的細胞則成排列狀生長,細胞形態(tài)和原代的相比變化不大。加入誘導培養(yǎng)液培養(yǎng)數(shù)天之后,細胞的形態(tài)逐漸的變短,漸漸的由梭形變化成為了不規(guī)則形態(tài),最終演變成了鋪路石樣,而這種細胞形態(tài)是內(nèi)皮細胞的特征性形態(tài)。
　　 2免疫細胞化學染色顯示

7、內(nèi)皮細胞的特征性抗原CD31、CD34、Ⅷ呈陽性。
　　 3流式細胞儀檢測結(jié)果顯示CD31陽性表達率為86.9％,Ⅷ因子陽性表達率82.5％,CD31/Ⅷ雙陽性率為70.9％。
　　 結(jié)論：
　　 1 BMSCs是一種具有多項分化能力的干細胞；
　　 2在內(nèi)皮細胞生長因子和堿性成纖維細胞因子的誘導下骨髓間充質(zhì)干細胞向血管內(nèi)皮細胞方向分化；
　　 3骨髓間充質(zhì)干細胞是組織工程心臟瓣膜理想的種子細胞。