類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎致病相關(guān)蛋白DDR2的功能研究.pdf

1、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis，RA)是一種病因不明、發(fā)病機(jī)制不清的慢性自身免疫性疾病。它的病程進(jìn)展綜合體現(xiàn)了炎癥急性期的滲出和慢性期的滑膜組織增生等病理生理過程。因此發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，有多種細(xì)胞、細(xì)胞因子和蛋白酶類參與。 DDR2是一類新發(fā)現(xiàn)的受體型蛋白酪氨酸激酶，其分子結(jié)構(gòu)由三部分組成：一是N端的DR區(qū)，二是在DR與跨膜區(qū)之間的很長(zhǎng)的鄰跨膜區(qū)(justatransmembraneregion，JM)，三是

2、在胞漿內(nèi)的胞內(nèi)區(qū)。它的胞外區(qū)的盤狀結(jié)構(gòu)域可以識(shí)別并結(jié)合膠原，在細(xì)胞的增殖、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移中具有重要作用。我們課題組近幾年對(duì)DDR2在RA中的作用的研究發(fā)現(xiàn)：1.RA滑膜細(xì)胞DDR2表達(dá)水平高于OA滑膜細(xì)胞。2.DDR2在滑膜組織不僅表達(dá)于滑膜細(xì)胞層，還表達(dá)于滑膜下層多種細(xì)胞，尤其在免疫細(xì)胞中表達(dá)量很高。3.體外培養(yǎng)的RA滑膜細(xì)胞仍持續(xù)分泌高水平的MMP-1，而在OA細(xì)胞培養(yǎng)上清中未檢測(cè)到。4.DDR2的配體為纖維型膠原(如Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型

3、膠原)，膠原與DDR2的相互作用可介導(dǎo)細(xì)胞增殖、上調(diào)細(xì)胞MMP-1和MMP-2的表達(dá)。 基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們推測(cè)，在RA關(guān)節(jié)中可能存在這樣一個(gè)病理過程：在異常的自身免疫狀態(tài)下，滑膜細(xì)胞中的DDR2在軟骨脫落的Ⅱ型膠原的作用下被激活，使滑膜細(xì)胞過表達(dá)MMP-1；膠原強(qiáng)大而持續(xù)的刺激使DDR2持續(xù)活化，滑膜細(xì)胞持續(xù)分泌MMP-1，這些持續(xù)分泌的MMP-1對(duì)軟骨造成嚴(yán)重的破壞；破壞的軟骨又可釋放大量的膠原物質(zhì)，這些膠原可進(jìn)一步作為MM

4、P-1的誘導(dǎo)因素，如此反復(fù)，周而復(fù)始。所以我們認(rèn)為，Ⅱ型膠原—DDR2-MMP-1環(huán)路可能是RA關(guān)節(jié)軟骨破壞的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，因此深入研究DDR2自身分子的功能將有助于豐富對(duì)DDR2參與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制的理解，為進(jìn)一步研究新的治療手段奠定基礎(chǔ)。 本課題從DDR2分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)出發(fā)，一方面以其胞外區(qū)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象研究和探討DDR2特異性阻斷劑。另一方面以其胞內(nèi)區(qū)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象研究其相互作用蛋白，為進(jìn)一步研究和揭示DDR2的生物學(xué)功能提供

5、新證據(jù)、新思路和新方向。我們的研究結(jié)果可歸納為以下幾點(diǎn)： 1.成功構(gòu)建了含有DDR2-DR基因片段的重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFBHTa-DR，并用CaCl2法轉(zhuǎn)化DH10Bac，獲得重組BacmidDNA，然后用LipofectAMINE法轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒Bac-DR并進(jìn)行了初步鑒定。PCR、IFA及Western-blot證實(shí)重組桿狀病毒成功感染sf9細(xì)胞，并在細(xì)胞中有明顯目的蛋白的表達(dá)，其表達(dá)的蛋白質(zhì)中可溶

6、性部分約占全部融合蛋白的9.4％；經(jīng)Ni-NTA(nitric-tri-aceticacid)柱純化后，獲得了純度約92％以上的可溶性His-DR融合蛋白。競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抑制實(shí)驗(yàn)表明，融合蛋白His-DR可阻斷或競(jìng)爭(zhēng)Ⅱ型膠原與NIH3T3細(xì)胞表面天然DDR2的結(jié)合。 2.RT-PCR和western-blot結(jié)果顯示，受膠原刺激后NIH3T3細(xì)胞中DDR2的活化程度增高，由其介導(dǎo)的MMP-1的表達(dá)無論從mRNA水平還是蛋白水平都明顯增

7、強(qiáng)，而融合蛋白His-DR可從以上兩個(gè)方面抑制MMP-1的表達(dá)水平，但不能完全抑制。 3.明膠酶譜實(shí)驗(yàn)顯示：膠原刺激后NIH3T3細(xì)胞培養(yǎng)上清中的MMP-2分泌水平增加，競(jìng)爭(zhēng)抑制膠原刺激后細(xì)胞培養(yǎng)上清中的MMP-2分泌水平有所下降。 4.構(gòu)建了6His融合的畢赤酵母重組表達(dá)載體，獲得了多拷貝整合的酵母表達(dá)菌株，并成功表達(dá)了6His-DR蛋白；利用Ni-NTA親合層析方法純化得到可溶形式的DR蛋白。競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抑制實(shí)驗(yàn)表明，融

8、合蛋白His-DR可阻斷或競(jìng)爭(zhēng)Ⅱ型膠原與RA滑膜細(xì)胞表面天然DDR2的結(jié)合。 5.對(duì)RA滑膜細(xì)胞的研究顯示，受膠原刺激后DDR2的活化程度增高，由其介導(dǎo)的MMP-1的表達(dá)無論從mRNA水平還是蛋白水平都明顯增強(qiáng)，而融合蛋白His-DR可從以上兩個(gè)方面抑制MMP-1的表達(dá)水平，但仍不能完全抑制。 6.明膠酶譜實(shí)驗(yàn)顯示：膠原刺激后RA滑膜細(xì)胞培養(yǎng)上清中的MMP-2分泌水平明顯增加，競(jìng)爭(zhēng)抑制膠原刺激后細(xì)胞培養(yǎng)上清中的MMP-2

9、分泌水平有所下降。 7.以DDR2胞內(nèi)區(qū)(DT)為誘餌，用酵母雙雜交篩選了其相互作用蛋白，通過低嚴(yán)謹(jǐn)度和高嚴(yán)謹(jǐn)度篩選，我們共篩選到15個(gè)克隆分別代表7種基因。 8.采用酵母雙雜交、免疫共沉淀和哺乳動(dòng)物細(xì)胞雙雜交系統(tǒng)驗(yàn)證了DDR2-DT蛋白與KBP蛋白之間的相互作用。該相互作用的真正生物學(xué)意義目前正在研究之中。 以上研究結(jié)果表明：1.無論是桿狀病毒還是畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)均能在靶細(xì)胞內(nèi)表達(dá)DDR2胞外區(qū)，但畢赤酵母表達(dá)

10、系統(tǒng)更利于靶蛋白的表達(dá)。2.融合表達(dá)的DDR2受體胞外區(qū)His-DR在一定濃度下可阻斷Ⅱ型膠原與RA滑膜和NIH3T3細(xì)胞表面的DDR2結(jié)合；His-DR可抑制膠原刺激下的RA滑膜細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞的MMP-1、MMP-2的分泌。提示阻斷DDR2可以減少細(xì)胞MMP-1、MMP-2的分泌，進(jìn)一步說明了DDR2介導(dǎo)Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的MMP-1、MMP-2的分泌。3.KBP和DDR2-DT相互作用的確認(rèn)為進(jìn)一步研究DDR2的功能提供了新的思路