RNA干擾凋亡抑制基因survivin表達及對骨肉瘤細胞系U-2OS相關生物學特性的影響.pdf

1、骨肉瘤是人類最常見的原發(fā)惡性骨腫瘤，最常見于20～30歲的年輕人。單純截肢治療患者常常在一年內死于肺轉移。隨著外科技術，影像學、化療放療的發(fā)展，患者長期生存率從10～20％上升到60～70％[1]。但是諸如腫瘤轉移、復發(fā)等問題仍然沒有得到完全解決。 隨著腫瘤的研究已進入到基因與分子水平，人們認識到腫瘤的發(fā)生是一個多因素參與、多種途徑、多階段的復雜過程，許多基因與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、演變相關，包括癌基因、抑癌基因、細胞凋亡基因、凋亡抑

2、制基因、細胞周期調節(jié)基因等，其中細胞內腫瘤相關基因，如癌基因、凋亡抑制基因、細胞凋亡基因等的異常表達是腫瘤發(fā)生的重要原因之一，它能引起細胞的某些生物學特性的變化，導致細胞無限制繁殖和癌變。腫瘤細胞凋亡抑制因子活性的增強，能抵抗細胞凋亡信號通路的激活，使腫瘤細胞逃避體內免疫系統(tǒng)的識別和清除，最后導致腫瘤的形成[2]。因此，特異性抑制細胞內凋亡抑制因子的表達己成為腫瘤治療新途徑。 細胞凋亡抑制因子(inhibitorofapopto

3、sis，IAP)家族是一類分布廣泛的抗凋亡蛋白，存在于病毒、酵母和哺乳動物細胞等生物中，家族成員在結構上的特點是具有一個或多個高度保守的約70個氨基酸重復序列，稱為桿狀病毒IAP重復序列(baculoviralIAPrepeat，BIR)，在功能上具有抑制細胞凋亡的作用。1997年耶魯大學的Ambrosini等用效應細胞蛋白酶受體Ⅰ(effectorcellproteasereceptorⅠ，EPRⅠ)cDNA在人類基因文庫中進行篩選，

4、克隆出的一個新基因，命名為survivin。Survivin結構較獨特，只有單一BIR，羧基末端不含環(huán)指結構，其基因定位于染色體17q25，有4個外顯子和3個內含子，基因全長14.7kb，編碼產生一個由142個氨基酸組成的分子量為16.5kDa的胞漿蛋白，為IAPs中分子量最小的成員[3-8]。Survivin表達于幾乎所有人類腫瘤組織中，但極少見于正常組織。Survivin區(qū)別于其它IAPs的最顯著的特點之一是在正常和腫瘤細胞中表達不

5、同，它在成熟的終末分化的組織中不表達，而在多數轉化細胞和腫瘤細胞中有較高水平的表達。應用免疫組化、Western雜交和原位雜交，檢測survivin基因幾乎在所有的人類癌癥中都有高水平的表達。研究資料顯示survivin在肺癌、乳腺癌、結腸癌、胃癌、肝癌、食管癌、胰腺癌、膀胱癌、子宮癌、卵巢癌、大細胞性非霍奇金淋巴瘤、黑色素瘤等惡性腫瘤中高表達，并與這些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后有密切關系[9-12。Survivin在腫瘤中廣泛分布，提示在

6、腫瘤中sur-vivin基因可能被解除了管制。研究表明在正常組織中survivin啟動子的活性非常低[11]。 目前認為survivin可能主要通過兩條途徑來抑制細胞凋亡，其一是通過直接抑制凋亡終末效應器caspase-3和caspase-7的活性，阻斷各種刺激誘導的細胞凋亡過程[13-17]。Lie[9]等研究靶向survivin的反義寡核苷酸對肺腺癌細胞株的作用，發(fā)現凋亡增加，caspase-3活性提高，細胞增生受抑制，對化

7、療藥物敏感性增加。其二是survivin與周期蛋白激酶cdk4相互作用阻斷凋亡信號傳導通路[10]。Survivin依賴的細胞增殖信號進入核內與cdk4結合，導致Cdk2/CyclinE激活和Rb磷酸化，Rb磷酸化后啟動細胞進入周期，加快G1-S期的轉換，同時使p21從cdk4中釋放出來，釋放的p2l易位到線粒體與procaspase-3形成復合物，抑制caspase-3的活性，阻斷線粒體釋放細胞色素c從而抑制細胞凋亡。Smith等[1

8、8]研究結果表明，在新發(fā)和復發(fā)的膀胱癌患者尿液中可檢測到survivin的表達，敏感性為100％，特異性為95％，呈陽性表達的患者復發(fā)率高，代表預后較差；因此，檢測尿液中survivin可作為一種早期，非侵入性的膀胱癌的方法。由于sur-vivin在正常分化的組織中不表達，而表達于腫瘤組織中，因此腫瘤患者機體免疫系統(tǒng)將視survivin蛋白為非己蛋白而產生免疫反應，因此可在腫瘤患者體內的血液中檢測到循環(huán)抗體[19-20]。Survivi

9、n選擇性地表達于腫瘤組織及其抗凋亡作用成為近年來腫瘤基因治療研究的熱點之一。目前主要是應用人工合成的survivin反義寡核苷酸、反義RNA以及負顯性突變體轉導入腫瘤細胞內抑制survivin表達，從而抑制腫瘤細胞增殖，促進其凋亡[21]。 在眾多治療方法的研究中，RNA干擾(RNAinterference，RNAi)技術是最近用于抑制基因表達的技術，主要用于基因功能和基因治療學等方面的研究。RNAi具有抑制作用強、穩(wěn)定性高、細

10、胞攝取相對容易等優(yōu)點。RNAi在基因功能分析、抗腫瘤和抗病毒基因治療等方面均得到廣泛應用[22-25]。它主要利用雙鏈RNA(double-strandedRNA，dsRNA)在細胞內Dicer內切酶的識別、結合、酶切下，產生有活性的長度為21-29nt小的干擾性RNA(shortinterferingRNA，siRNA)，通過堿基互補原理，與目的基因mRNA結合并使之降解，從而抑制目的基因的表達。RNAi的發(fā)現為基因功能學和基因治療學

11、等提供了有效的研究方法[26]，已被《科學》雜志評為2002年最重要科技發(fā)現之一[27]。 RNAi是一種進化上保守的基因組水平的細胞內監(jiān)控機制，dsRNAs在哺乳動物細胞內可以活化兩條途徑：超過30bp的dsRNAs引起廣泛的非特異性mRNA的降解和翻譯的關閉，體外合成的短的19-23nt的dsRNAs分子模擬RNAi途徑中間體，引起序列特異性的基因表達抑制[28-32]。研究表明RNAi具有很強的抑制目的基因作用：Paul[

12、33]等應用laminA/C的RNAi抑制laminA/C的活性，并與laminA/C的反義寡核苷酸進行比較，結果顯示，前者具有明顯的抑制作用，而后者的抑制作用則較低。Wilda[34]等在研究RNAi和反義寡核苷酸對熒光素酶的抑制作用時也得到同樣的結論。由于RNAi在沉寂目的基因表達方面的優(yōu)勢，正逐漸取代寡核苷酸，成為新的基因表達干預技術[24]。 本研究應用RNAi技術，研究在骨肉瘤細胞株U-2OS中轉染針對survivin

13、的siRNA后，survivinmRNA水平和蛋白表達的變化，觀察siRNA作用后，對U-2OS細胞生物學特性的影響。本文共分三部分，第一部分：survivinsiRNA在骨肉瘤細胞株U-2OS中抑制survivin的表達；第二部分：Survivin-siRNA誘導骨肉瘤細胞U-2OS的凋亡及對其相關生物行為的影響；第三部分：Survivin和MMP-9在骨肉瘤中的表達及相關性研究。 本研究通過實驗得出如下結論： 1.體