RNA干擾技術(shù)沉默PTHrP基因影響軟骨肉瘤細胞增殖和凋亡的研究.pdf

1、目的:構(gòu)建針對目的基因PTHrP的表達載體pSilencerTM 3.1H1 neo vectorsiRNA，研究其對人軟骨肉瘤細胞增殖活性及其相關(guān)因子分泌的影響，為RNA干擾技術(shù)用于軟骨肉瘤基因治療提供理論基礎(chǔ)。 方法: 1.PTHrP shRNA轉(zhuǎn)錄模板DNA鏈的設(shè)計、合成按siRNA設(shè)計原則，設(shè)計針對PTHrP基因cDNA(序列號GeneID：5744)364～384位置堿基序列的siRNA。再根據(jù)siRNA序列設(shè)

2、計總長度為63bp的shRNA轉(zhuǎn)錄模板DNA正、反義鏈各一條。 2.構(gòu)建shRNA重組表達載體 將等量的對應(yīng)模板的DNA序列的正、反義兩條轉(zhuǎn)錄shRNA，退火后克隆至pSilencerTM3.1H1 neo vector，重組載體命名為pSilencerTM3.1H1 neo-siPTHrP。將重組載體轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞(DH5 α)，提取重組載體用限制性內(nèi)切酶BamH I、HindⅢ將其切成兩條片段，瓊脂糖凝膠電泳觀察插

3、入片段及載體片段的分子量以作初步鑒定；菌液送至上海生工進行重組載體的基因測序。 3.擴增和提取重組載體初步鑒定正確后分別將含有空質(zhì)粒和重組載體的菌液加到LB瓊脂湯中擴大培養(yǎng)并高純度提取質(zhì)粒。 4.體外實驗 用siPORT XP-1將重組載體轉(zhuǎn)染到人軟骨肉瘤SW1353細胞中，以空質(zhì)粒pSliencer及正常軟骨肉瘤細胞分別作陰性對照和空白對照。分別在轉(zhuǎn)染后的24h、48h、72h、96h用MTT方法檢測細胞增殖活

4、性；用ANNEXIN-FITC/PI雙染法檢測細胞的早期凋亡率；經(jīng)過一個月的G418抗生素壓力篩選，采用半定量RT-PCR法和蛋白免疫印跡法檢測各組細胞的PTHrP、Bcl-2、Caspase-3、Col2α1mRNA表達和蛋白表達情況。 結(jié)果: 1.限制性酶切及測序證實質(zhì)粒pSilencerTM3.1H1 neo-siPTHrP構(gòu)建成功。 2.siPTHrP轉(zhuǎn)染組的細胞生長較正常軟骨肉瘤細胞受到明顯抑制；穩(wěn)定轉(zhuǎn)