miR-192靶向TCF7基因對骨肉瘤細胞增殖和侵襲的抑制作用.pdf

1、研究背景：
　　骨肉瘤（osteos arco ma）是較常見的惡性骨腫瘤，主要影響兒童和青少年。骨肉瘤具有較強的遷移能力，導致許多患者死于肺轉移。雖然人們在骨肉瘤的治療上投入很多精力，但患者五年生存率仍僅達60％-70%。目前，人們的研究主要集中在后基因組方面，因此，從基因水平上探討骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制，尋找新的診斷和防治方法顯得尤為重要。MicroRNA（miRNA）是一類保守的內(nèi)源性非編碼小RN A，通過轉錄和轉錄后水平

2、調控基因的表達。miRN A參與許多生物過程，如細胞的增殖、血管生成、細胞代謝等，其異常表達與腫瘤的發(fā)生及進展密切相關。最新研究報道，miR-192在多種腫瘤細胞中低表達，如肺癌、直腸癌、肝癌、乳腺癌、膀胱癌和骨肉瘤。然而，關于miR-192對骨肉瘤細胞生物學行為的影響尚未見報道。因此，探討miR-192對人骨肉瘤細胞的增殖、凋亡及侵襲遷移的影響，揭示其相關的作用機制，將為骨肉瘤的臨床防治提供新的思路和策略
　　研究目的：

3、　　本實驗通過骨肉瘤患者組織標本，檢測骨肉瘤組織及其癌旁組織中miR-192及TCF7基因表達差異。采用骨肉瘤U-2OS和MG63細胞，觀察轉染miR-192對骨肉瘤增殖、凋亡及侵襲遷移的影響，并初步探索miR-192的生物靶標及其調控機制，為miRN A在骨肉瘤的防治的作用提供實驗依據(jù)和新靶點。
　　方法：
　　1.在鄭州大學第一附屬醫(yī)院（2013年6月至2015年3月期間）收集20例骨肉瘤患者癌組織及其癌旁組織標本，-8

4、0℃保存。使用熒光實時定量PCR（real-time quantitative PCR,RT-qPCR）方法檢測20例骨肉瘤組織及其癌旁組織標本中miR-192及TCF7基因 mRNA的表達水平，并分析二者之間的關系。同時采用免疫印跡法（Western blot）檢測TCF7蛋白的表達水平。
　　2.采用RT-qPCR方法檢測成骨細胞hFOB1.19，骨肉瘤細胞U-2OS和MG63中miR-192及TCF7基因的mRN A表達水平

5、。
　　3.合成miR-192 agomir和miR-192 negative control，并采用脂質體轉染法將其分別轉入骨肉瘤細胞U-2OS和MG63中。實驗分組如下：
　?、賛iR-192組：轉染miR-192 a go mir。
　　②NC組：轉染miR-192 negative control。
　　③Blank組：僅轉染試劑脂質體。
　　4.CCK-8法檢測細胞生長實驗和集落形成實驗，觀察mi

6、R-192對骨肉瘤細胞增殖的影響。
　　5.流式細胞術和Caspase酶活性實驗，觀察miR-192對骨肉瘤細胞凋亡的影響。
　　6.細胞劃痕實驗，觀察miR-192對骨肉瘤細胞遷移能力的影響。
　　7.Tra nswe ll實驗，觀察miR-192對骨肉瘤細胞遷移和侵襲能力的影響。
　　8.采用PicTar、miRwalk、TargetScan和miRanda等生物信息學軟件預測miR-192的作用靶標。同時構

7、建含有TCF7的3’-UTR區(qū)的野生型和突變型的重組雙熒光素酶報告基因載體，分別將其與miR-192 agomir或miR-192 negative control一起共轉染入骨肉瘤細胞U-2OS和MG63中，并運用Western blot實驗方法和雙熒光素酶報告實驗證實TCF7是miR-192的作用靶標。
　　9.Western blot檢測各組細胞轉染miR-192 agomir后，骨肉瘤細胞U-2OS及MG63中細胞周期蛋白

8、CyclinD1，凋亡抑制蛋白Survivin和與侵襲遷移相關的蛋白Sna il的表達。
　　結果：
　　1.與癌旁組織相比，骨肉瘤組織中，miR-192的表達明顯降低(P<0.01)，TCF7 mRNA的水平明顯升高(P<0.01)，并且miR-192的表達與TCF7 mRNA的水平呈負相關。此外，骨肉瘤組織中TCF7的蛋白表達也高于癌旁組織。
　　2.骨肉瘤細胞U-2OS和MG63中，miR-192的表達明顯低于成

9、骨細胞hFOB1.19(P<0.01)，TCF7 mRNA表達明顯高于成骨細胞hFOB1.19(P<0.01)。
　　3.轉染miR-192 ago mir后，miR-192轉染組的miR-192表達水平顯著高于NC組和Blank組，其差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。表明骨肉瘤細胞轉染miR-192后，骨肉瘤細胞的miR-192表達水平明顯上調。
　　4.CCK-8（Cell Counting Kit）生長實驗和集落形成

10、結果顯示，與NC組和Blank組比較，miR-192組的骨肉瘤細胞在OD450處的吸光度值明顯下降，集落形成數(shù)目也明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而NC組和Blank組間比較骨肉瘤細胞的吸光度和集落形成數(shù)目無顯著性差異(P>0.05)。
　　5.流式細胞術檢測細胞凋亡實驗和Caspase-3酶活性檢測實驗結果顯示，與NC組和Blank組比較，miR-192組骨肉瘤細胞的細胞凋亡率和Caspase-3酶活性均明顯升高，

11、其差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而NC組和Blank組間比較骨肉瘤細胞的凋亡數(shù)和Caspase-3活性無顯著性差異(P>0.05)。
　　6.Transwell實驗結果顯示，與NC組和Blank組相比較，miR-192組的骨肉瘤細胞穿過基底膜的細胞數(shù)明顯減少，其差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而 NC組和Blank組間比較穿過基底膜的骨肉瘤細胞數(shù)無顯著性差異(P>0.05)。
　　7.劃痕實驗結果提示，與NC組和B

12、lank組比較，miR-192組細胞的遷移能力明顯降低，而N C組和Bla nk組間比較細胞的遷移能力無顯著性差異。
　　8. Western blot和雙熒光素酶報告實驗結果提示，TCF7是miR-192的作用靶標。
　　9.Western blot結果提示，轉染miR-192 agomir后，與NC組和Blank組比較，miR-192組中，細胞周期蛋白CyclinD1，凋亡抑制蛋白Survivin與侵襲遷移相關的蛋白Sn

13、ail的表達均下降，而NC組與Blank組比較，細胞中CyclinD1，Survivin和Snail蛋白的表達無差異。
　　結論：
　　1.骨肉瘤組織和細胞中，miR-192異常低表達，TCF7高表達，二者呈現(xiàn)負相關。
　　2.miR-192通過作用于TCF7的3’-UTR區(qū)負向調控其表達，并抑制其下游相關基因CyclinD1，Survivin和Snail的表達，從而發(fā)揮生物學作用。
　　3.上調骨肉瘤細胞中mi