血管加壓素對健康雄性大鼠近端結(jié)腸離體肌條收縮活動的影響及其機制研究.pdf

1、血管加壓素(AVP)是由神經(jīng)垂體分泌的九肽激素，主要的生理作用是收縮血管和抗利尿。AVP受體屬于G-蛋白偶聯(lián)的膜受體，包括V1血管受體(V1Rs)、V2腎臟受體(V2Rs)和V3垂體受體(V3Rs)三個亞型。AVP作為一種非腎上腺素能縮血管物質(zhì)，已廣泛應(yīng)用于臨床治療，為危重病人提供血壓支持或抑制胃腸道出血等。但該治療方法常伴有消化道損傷，這可能與AVP減少組織灌流引起缺血性組織損傷或影響消化道平滑肌收縮功能有關(guān)。
　　 已有報道

2、證明AVP受體在人胃腸道上廣泛表達。AVP對胃腸道動力的影響存在濃度依賴性，且存在種屬間差異。生理水平的AVP不改變大鼠和人結(jié)腸平滑肌收縮，但外源性AVP或應(yīng)急狀態(tài)下血液中AVP濃度增高對消化道運動的影響及其機制尚不明確。
　　 我們前期的研究發(fā)現(xiàn)靜脈注射AVP引起大鼠結(jié)腸收縮減弱。一氧化氮(NO)是胃腸道平滑肌主要的舒張因子，由一氧化氮合酶(NOS)催化底物L(fēng)-精氨酸分解生成。NO在消化道各部分生理病理功能調(diào)節(jié)中起到重要作用，

3、影響食管下部括約肌、幽門、Oddi括約肌和肛門等處平滑肌張力，參與腸蠕動反射。大量研究證明NOS抑制劑可以延遲胃排空和阻礙結(jié)腸運動。細胞內(nèi)NOS蛋白表達下降引起局部NO量合成減少可能與多種消化道動力異常有關(guān)。有研究提示AVP促進心肌纖維原細胞生成NO，因此我們推測AVP可能通過激活一氧化氮合酶(NOS)，增加NO釋放而抑制結(jié)腸平滑肌收縮。本研究將對以上假設(shè)進行驗證。
　　 材料與方法：
　　 實驗動物
　　 實驗

4、選用雄性Wistar大鼠，體重約為280 g～320 g，實驗前禁食12 hr，自由飲水。
　　 離體肌條制備
　　 快速犧牲大鼠，距回盲部1 cm處取近端結(jié)腸組織。沿腸系膜方向?qū)⒛c管剪開，用Krebs液反復(fù)沖洗后，黏膜面朝上固定在石蠟盤中，盤內(nèi)持續(xù)通有95％O2和5％CO2的混合氣體。用眼科剪仔細去除黏膜。沿垂直于腸軸方向?qū)⒔M織剪裁為8×3 mm大小的近端結(jié)腸環(huán)行肌條。
　　 離體肌條收縮活動記錄
　　

5、 將處理好的肌條放置于灌流浴槽中。浴槽內(nèi)盛有5 ml37℃krebs液和持續(xù)通有95％O2和5％CO2的混合氣體。肌條一端固定在浴槽底部的玻璃彎鉤上，另一端與張力換能器相連。肌條收縮活動以張力信號形式輸入生理記錄儀。肌條在1 g的前負荷下孵育60 min，每隔15 min換用新鮮的37℃krebs液沖洗，待其自發(fā)收縮穩(wěn)定后開始實驗。每個環(huán)行肌條只接受一次AVP處理。加藥后，連續(xù)記錄肌條收縮活動30 min。在需要用阻斷劑預(yù)處理的實驗中，

6、肌條先用阻斷劑孵育10 min～30 min，然后再加入AVP處理。所用阻斷劑包括[deamino-Pen1，O-Me-Tyr2，Arg8]-Vasopressin(V-1880，V1受體(V1 Rs)阻斷劑)，Pyrrolidinedithiocarbamate(PDTC，NF-κB阻斷劑)，N(G)-nitro-L-arginine methyl ester(L-NAME，NOS非特異性阻斷劑)，S-methylisothioure

7、(SMT，iNOS特異性阻斷劑)，tetrodotoxin(TTX，河豚毒素)和N-Propyl-L-Arginine(NPLA，nNOS特異性阻斷劑)。
　　 免疫組化
　　 取大鼠近端結(jié)腸組織，用4％多聚甲醛固定后，石蠟包埋，制成厚4μm的切片。石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化處理，再用3％H2O2孵育10 min，以滅活其中內(nèi)源性過氧化物酶。磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)沖洗三次，5

8、％牛血清封閉1 hr，然后加兔抗iNOS(1:200)抗體或羊抗V1Rs抗體(1:100)4℃過夜。PBS沖洗，滴加生物素標(biāo)記的二抗工作液室溫孵育30 min。沖洗后，滴加辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記鏈酶卵白素工作液室溫孵育30 min。PBS沖洗三次，最后用3，3-二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)鏡下顯色，蘇木素復(fù)染。PBS代替一抗孵育切片作為陰性對照。
　　

9、 免疫熒光雙標(biāo)
　　 V1Rs和NeuN
　　 制備大鼠近端結(jié)腸石蠟切片。5％牛血清封閉后，同時滴加羊抗V1Rs多克隆抗體(1:100)和小鼠抗神經(jīng)元細胞核(neuronal nuclei，NeuN)單克隆抗體(1:100)。將切片置于濕盒內(nèi)，4℃過夜。PBS沖洗后，同時滴加四甲基異氰酸羅達明(TRITC)兔抗羊IgG(1:50)和異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記兔抗小鼠IgG(1:50)，室溫孵育1 hr。
　　

10、 V1Rs和iNOS
　　 實驗步驟同前，使用的一抗為羊抗V1Rs多克隆抗體(1:100)和兔抗iNOS多克隆抗體(1:200)。使用二抗為FITC標(biāo)記驢抗羊IgG(1:50)和TRITC標(biāo)記驢抗兔(1：50)。
　　 熒光顯微鏡下觀察免疫陽性細胞，拍照。
　　 細胞核蛋白/漿蛋白的提取
　　 取大鼠近端結(jié)腸環(huán)行肌條，經(jīng)AVP或生理鹽水(NS)處理5 min后，加入細胞漿蛋白抽提試劑A勻漿。將勻漿液劇烈

11、震蕩，4℃離心，吸取上清即為抽提得到的細胞漿蛋白液。隨后，完全吸盡殘余的上清，沉淀內(nèi)加入50μl添加了苯甲基磺酰(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)的細胞核蛋白抽提試劑B，4℃震蕩30 min，4℃，12000 g離心10 min，吸取上清即為抽提得到的細胞核蛋白。
　　 Western Blot
　　 用蛋白濃度測定試劑盒對以上蛋白提取液進行定量分析。電泳結(jié)束后用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到

12、硝酸纖維素膜上，室溫下5％脫脂奶粉封閉1 hr，TTBS(Tris Buffer Saline withTween-20)多次沖洗。使用兔抗iNOS(1:500)、兔抗NF-κB(P65)(1:500)或兔抗Ⅰ-κB(1：800)一抗孵育4℃過夜。TTBS沖洗，室溫下辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1:20000)孵育1hr。ECL顯影。
　　 NO含量的測定
　　 取大鼠近端結(jié)腸環(huán)行肌條，去黏膜，經(jīng)AVP(10-8 mol/

13、L)或生理鹽水(NS)處理5min后勻漿。勻漿液在4℃離心5 min(4000 g)后，取50μl上清液與Griess試劑Ⅰ和Ⅱ室溫混合孵育。酶標(biāo)儀560 nm測定其吸光度。
　　 統(tǒng)計分析
　　 離體肌條實驗：實驗中持續(xù)記錄肌條等長收縮。定量分析時，軟件對曲線下面積每10s做一次積分，1 min內(nèi)積分總和與時間(60 s)的比值則為該時間段內(nèi)的肌條平均張力。加藥前肌條平均張力值作為參考值，并標(biāo)準(zhǔn)化為1；加藥后肌條平均張

14、力值與該參考值的比值為R值。
　　 Western Blot：應(yīng)用Scion Image分析軟件進行蛋白定量分析。內(nèi)參蛋白(胞核蛋白，c-jun；胞漿蛋白，β-actin)的灰度值標(biāo)準(zhǔn)化為100％，目的蛋白的灰度值與內(nèi)參蛋白的灰度值之比為統(tǒng)計指標(biāo)。
　　 所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用單因素方差分析和t檢驗進行統(tǒng)計學(xué)處理，以P<0.05為顯著性差異界值。
　　 結(jié)果：
　　 (1)AVP對大鼠近端結(jié)

15、腸環(huán)行肌收縮的影響。孵育液中加入AVP(10-8 mol/L)后環(huán)行肌收縮明顯減弱，加藥后5 min肌條張力降至最低，R值降為0.63±0.06(P<0.05，n=13)然后逐漸恢復(fù)，在12 min恢復(fù)至0.86±0.03(P>0.05，n=13)。外源性AVP(10-10～10-3mol/L)使肌條自發(fā)收縮減弱，且該作用呈劑量-反應(yīng)關(guān)系。當(dāng)AVP濃度低至10-11 mol/L時AVP不影響肌條收縮。V1Rs特異性阻斷劑V-1880(1

16、0-7 mol/L)可以消除AVP(10-8mol/L)對肌條收縮的抑制作用。V-1880(10-7 mol/L)本身對肌條收縮活動無明顯影響。
　　 (2)NOS抑制劑的作用。L-NAME(NOS非特異性阻斷劑，10-4 mol/L)和NPLA(nNOS特異性阻斷劑，10-7 mol/L)能夠增強大鼠結(jié)腸環(huán)行肌條自發(fā)性收縮，而SMT(iNOS特異性阻斷劑，10-3mol/L)對肌條收縮無影響。肌條用生理鹽水(NS)、L-NAM

17、E(10-4mol/L)或NPLA(10-7mol/L)處理5 min后，其R值分別為0.91±0.02(n=15)、1.02±0.06，(n=15，P<0.05)和0.99±0.01，(n=15，P<0.05)。L-NAME(10-4 mol/L)、NPLA(10-7 mol/L)或SMT(10-3 mol/L)均明顯減弱AVP對肌條收縮的抑制作用。
　　 (3)腸神經(jīng)系統(tǒng)的作用。TTX(河豚毒素)本身能夠興奮大鼠結(jié)腸環(huán)行肌收

18、縮。肌條浴液中加入TTX(10-5 mol/L)5 min后，張力R值從0.91±0.02(對照組)升高到1.07±0.04。TTX(10-5 mol/L)預(yù)處理后再加AVP，AVP抑制環(huán)行肌條收縮的作用明顯減弱。
　　 (4)AVP對iNOS表達和NO產(chǎn)生的影響。AVP(10-8 mol/L)處理肌條后，其iNOS表達和NO生成量明顯增加。肌條用AVP(10-8 mol/L)處理后5 min，組織中NO濃度由13.72μmol

19、/L±0.6μmol/L(對照組)增加到為23.76μmol/L±0.9μmol/L(P<0.05，n=6)，組織內(nèi)iNOS蛋白表達量高于對照組2.09±0.6倍(P<0.05，n=4)。阻斷劑SMT預(yù)孵育能夠抑制AVP(10-8 mol/L)增加肌條合成NO的作用。NF-κB阻斷劑PDTC預(yù)孵育能夠抑制AVP(10-8 mol/L)誘導(dǎo)的肌條iNOS表達上調(diào)，減弱AVP對肌條收縮的抑制。
　　 (5)AVP對NF-κB活性的影

20、響。肌條組織經(jīng)AVP(10-8 mol/L)孵育5 min后胞漿內(nèi)Ⅰ-κB表達明顯減少，而胞核內(nèi)NF-κB(P65)表達增加。AVP(10-8mol/L)處理肌條5 min后用Western blot測蛋白表達量變化，加藥組與對照組相比其胞漿內(nèi)Ⅰ-κB蛋白量減少了26.3％±5.36％(P<0.05，n=4)，而胞核內(nèi)NF-κB表達增加了4.3±0.4倍(P<0.05，n=6)。使用PDTC(10-3 mol/L)預(yù)處理后AVP不再影響

21、胞漿內(nèi)Ⅰ-κB和胞核內(nèi)P65表達。
　　 (6)免疫熒光定位V1Rs和iNOS。V1Rs陽性細胞位于正常大鼠近端結(jié)腸腸神經(jīng)叢內(nèi)。免疫熒光雙標(biāo)證實V1Rs和NeuN共同表達與肌間神經(jīng)元。AVP(10-7 mol/L)處理5 mim后結(jié)腸組織iNOS陽性細胞位于肌間神經(jīng)叢內(nèi)，而用生理鹽水(NS)處理的樣本內(nèi)并無iNOS表達。免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果證實iNOS與V1R共同表達于肌間神經(jīng)元。
　　 結(jié)論：
　　 AvP能夠抑制