催產(chǎn)素對十二指腸離體肌條收縮的影響及其機制.pdf

1、催產(chǎn)素(Oxytocin,OT)經(jīng)典的生理作用是誘發(fā)子宮和乳腺小葉間平滑肌收縮。近年來,越來越多的研究表明OT及OT受體分布于人體整個消化道的各個部分,直接或間接控制平滑肌運動,因此我們推測,OT可能是一種胃腸激素或神經(jīng)肽,調節(jié)消化道活動。
　　 膽囊收縮素(Cholecystokinin,CCK)既是一種經(jīng)典的胃腸激素,又是一種神經(jīng)肽,對消化道的功能具有廣泛的調節(jié)作用。我們曾發(fā)現(xiàn)腹腔注射OT抑制大鼠胃及小腸運動,這種作用可能是

2、通過促進CCK釋放實現(xiàn)的,但OT促進CCK釋放的部位和詳細機制尚不清楚。我們最近的研究也發(fā)現(xiàn),在整體情況下,靜脈注射OT通過CCK抑制大鼠胃的運動,但OT對離體胃肌條卻無此影響。因此我們推測,OT通過促進小腸粘膜或腸神經(jīng)叢釋放CCK,后者引起消化道運動的抑制。為了證實該假設,我們采用監(jiān)測十二指腸肌條張力的方法,在離體水平研究了外源性OT對十二指腸運動的影響,并探討了CCK和腸神經(jīng)叢(entericnervous system)在其中的作

3、用;通過RT-PCR和ELISA技術檢測了OT處理后十二指腸組織中CCK mRNA及其蛋白的表達,用免疫組織化學方法對十二指腸內(nèi)的OTR和CCK進行定位。本課題將探明OT對十二指腸運動的調節(jié)作用及其機理,弄清CCK在其中所起的作用,從而為探明OT在消化道運動調節(jié)方面的生理意義提供實驗依據(jù)。
　　 材料與方法
　　 離體肌條的制備和肌張力記錄
　　 實驗選用健康雄性Wistar大鼠,280-300 g,實驗前禁食1

4、8 h,自由飲水?？焖贍奚笫?迅速取出十二指腸(距離幽門1 cm),放置在充滿柯氏液的培養(yǎng)皿中,持續(xù)供給含95％氧氣和5％二氧化碳的混合氣體。在培養(yǎng)皿中將十二指腸沿腸系膜方向剪開,展開平鋪于培養(yǎng)皿中,用清潔圖釘固定,并沿與縱行平滑肌纖維平行的方向取出十二指腸縱行肌肌條(10×4 mm)。將各個肌條分別安置于灌流肌槽中,每個灌流槽中均盛有5 ml37℃Krebs液并持續(xù)供給95％O2和5％CO2混合氣體。肌條的一端固定在肌槽底部的玻璃彎

5、鉤上,另一端連接張力換能器(JH-2B,北京航天醫(yī)學工程研究所),肌肉張力信號在生物信號記錄分析系統(tǒng)(ML136-生物信號放大器和ML785-POWERLAB八通道記錄儀,悉尼Adinstrments公司)上記錄及分析。肌條在1 g的前負荷下孵育至肌條自發(fā)收縮活動平穩(wěn)后,加入不同濃度的OT,觀察肌條張力的變化。
　　 肌條分別觀察經(jīng)atosiban(OT受體阻斷劑),lorglumido(選擇性CCK1受體阻斷劑)和TTX(電壓

6、門控Na+通道阻斷劑)預處理后加入OT,觀察上述阻斷劑是否影響OT對十二指腸縱行肌條運動的作用。
　　 RT-PCR
　　 如上犧牲大鼠后取出十二指腸腸段,OT孵育后在trizol內(nèi)勻漿并提取RNA。按照反轉錄試劑盒的說明進行RNA反轉錄,擴增引物購自Invitrogen公司。
　　 ELISA
　　 分離并培養(yǎng)的十二指腸縱行肌-肌間神經(jīng)叢標本(longitudinal musclemyenteric p

7、lexus,LMMP)上的細胞,培養(yǎng)液中加入不同劑量OT孵育30 s后離心并取上清液。按CCK ELISA試劑盒(購自GBD公司)的說明進行CCK檢測。
　　 免疫組織化學
　　 (1)標記OTR:新鮮十二指腸石蠟切片,3％H2O2滅活過氧化物酶活性,山羊抗OTR多克隆抗體(1∶50)4℃過夜。PBS沖洗后二抗孵育,鏡下顯色,蘇木素復染,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。
　　 (2)標記CCK:新鮮十二指

8、腸石蠟切片,3％H2O2滅活過氧化物酶活性,兔抗CCK多克隆抗體(1∶150)4℃過夜。PBS沖洗三次后滴加山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體工作液室溫孵育30 min,PBS沖洗3次DAB鏡下顯色,蘇木素復染,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。
　　 免疫熒光三標
　　 新鮮十二指腸石蠟切片,厚度為4μm,常規(guī)脫蠟,水化。枸櫞酸鹽抗原修復,5％正常驢血清封閉。同時滴加兔抗大鼠CCK多克隆抗體(1∶150)、山羊抗大

9、鼠OTR多克隆抗體(1∶50)和小鼠抗大鼠NeuN單克隆抗體(1∶50)。將切片置于濕盒內(nèi),4℃過夜。PBS沖洗3次,每次5 min。然后同時滴加標記RB-200標記的驢抗兔、FITC標記的驢抗山羊和CyTM5標記的驢抗小鼠的熒光二抗,室溫孵育60 min。PBS沖洗3次,每次5 min。甘油緩沖液封片,熒光顯微鏡下觀察結果,拍照。
　　 統(tǒng)計學處理
　　 在離體肌條實驗中,以肌條平均張力為觀察指標,加入OT前3 min

10、的平均張力基礎值,加入OT后不同時間段的平均張力為效應值,效應值與基礎值的比值為統(tǒng)計指標R。
　　 所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準誤表示,采用單因素方差分析、t檢驗進行統(tǒng)計學處理,以P＜0.05為顯著性差異界值。
　　 實驗結果:
　　 1.加入三種濃度的OT到浴槽中,其終濃度分別為10-7 M,10-6 M,10-5 M,肌條的自發(fā)收縮活動受到抑制。以加入10-6 M OT后對肌條的抑制作用最明顯。加入三種濃度催產(chǎn)素

11、后30 s R值分別降低到0.838±0.021(P＜0.05.n=6),0.759±0.842(P＜0.05,n=6)。1 min后肌條的自發(fā)收縮活動恢復。
　　 2.OT受體阻斷劑atosiban(10-6M)完全阻斷了OT對十二指腸縱行肌條的抑制作用。Astosiban預處理10 min再加入OT30 s和單獨加入OT30 s兩組肌張力的R值分別為0.758±0.025和1.053±0.009,兩者相比有顯著差異(P＜0.

12、05,n=6)。
　　 3.電壓依賴性Na+離子通道阻斷劑TTX(10-5 M)完全阻斷了OT對十二指腸縱行肌條的抑制作用。TTX預處理30 min加入OT30 s與單獨加入OT后30 s兩組肌張力的R值分別是0.758±0.025和1.049±0.040(P＜0.05,n=6)。
　　 4.選擇性CCK1受體阻斷劑lorglumide(3×10-6 M)孵育后,OT抑制十二指腸的作用被完全逆轉。Lorglumide預處

13、理15 min再加入OT30 s和單獨加入OT30s兩組肌張力的R值分別是0.758±0.025和0.979±0.015(P＜0.05,n=6)。
　　 5.OT處理后組織中CCK mRNA的總量沒有發(fā)生明顯變化。
　　 6.OT處理后神經(jīng)細胞培養(yǎng)中CCK蛋白的量明顯增多。加入OT(10-6M)后30 s細胞培養(yǎng)液中CCK的濃度由加入OT前的10.856±0.248升至11.914±0.185(P＜0.05,n=6)。A

14、tosiban預處理10 min再加入OT30 s,與單獨加入OT30 s,細胞培養(yǎng)液中CCK的濃度分別是13.530±0.217和12.438±0.263(P＜0.05,n=6)。
　　 7.免疫組織化學實驗發(fā)現(xiàn),肌間神經(jīng)叢的神經(jīng)元上有OTR和CCK表達,免疫組織熒光三標實驗結果顯示,OTR和CCK共同表達于十二指腸肌間神經(jīng)叢同一神經(jīng)元上。
　　 結論
　　 1.OT通過腸神經(jīng)叢上的OT受體抑制大鼠十二指腸的運