聚乳酸聚乙醇酸-RNAⅢ抑制肽緩釋微球的制備和預(yù)防骨科內(nèi)植物葡萄球菌感染的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 骨科內(nèi)植物感染一直是個(gè)棘手的問(wèn)題，人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后感染更是災(zāi)難性的并發(fā)癥，治療也更具挑戰(zhàn)性。骨科內(nèi)植物感染以產(chǎn)生物被膜的金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌引起的慢性感染最為常見(jiàn)，由于細(xì)菌耐藥問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重，所以迫切需要更加有效的方法來(lái)治療耐藥菌引起的骨科內(nèi)植物尤其是人工關(guān)節(jié)感染。研究證明RIP可以抑制所有葡萄球菌菌株的毒性，是一種作用機(jī)制不同于傳統(tǒng)抗菌素的全新制劑，本研究采用固相合成法、反相液相色譜法合成并提純得到高純度RIP

2、，改良復(fù)乳-溶劑揮發(fā)法制備PLGA/RIP緩釋微球，分析其表征；體外研究PLGA/RIP緩釋微球的洗提學(xué)特征和抑菌活性，并對(duì)PLGA/RIP緩釋微球的組織相容性和血液相容性進(jìn)行評(píng)價(jià)；在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上建立全新的兔膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后慢性感染的模型，以期真實(shí)模擬-臨床上常見(jiàn)的慢性感染，研究PLGA/RIP緩釋微球在體內(nèi)預(yù)防表皮葡萄球菌造成的兔膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后慢性感染的效果。 方法： 1、PLGA/RIP緩釋微球的構(gòu)建和體外洗提學(xué)研

3、究：根據(jù)已知的氨基酸序列，采用固相合成法合成RIP粗品，利用反相高效液相法對(duì)RIP粗品進(jìn)行純化，對(duì)純化后的RIP肽進(jìn)行質(zhì)譜分析、氨基酸組成分析、氨基酸序列分析和紅外光譜分析．采用改良復(fù)乳-溶劑揮發(fā)法制備PLGA/RIP緩釋微球，觀察其表征，測(cè)定緩釋微球的載藥率和包封率．采用高效液相色譜法測(cè)定不同時(shí)點(diǎn)不同濃度PLGA/RIP洗提液的pH值變化，RIP的釋放速度、累積釋放量和洗提液中RIP的濃度，觀察PLGA/RIP微球的體外釋藥特點(diǎn)。通過(guò)

4、PLGA/RIP緩釋系統(tǒng)對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC25923的抑制，測(cè)定其有效抑菌環(huán)直徑，比較不同時(shí)點(diǎn)洗提液抑菌環(huán)直徑大小，判斷不同濃度洗提液抑菌活性大小． 2，體外研究PLGA/RIP緩釋微球的血液相容性和組織相容性：選擇溶血實(shí)驗(yàn)、凝血實(shí)驗(yàn)、血小板聚集實(shí)驗(yàn)，測(cè)定凝血酶原時(shí)間和活化部分凝血酶時(shí)間、觀察PLGA/RIP緩釋微球?qū)ν冒准?xì)胞、紅細(xì)胞和血小板的影響，對(duì)PLGA/RIP血液相容性進(jìn)行評(píng)價(jià)．選擇急性全身毒性試驗(yàn)、MTT細(xì)胞毒性

5、試驗(yàn)、肌肉內(nèi)植入試驗(yàn)、過(guò)敏試驗(yàn)和熱源試驗(yàn)，對(duì)聚乳酸乙醇酸/RNAⅢ抑制肽緩釋微球的組織相容性進(jìn)行評(píng)價(jià)。 2、PLGA/RIP緩釋微球預(yù)防兔膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后葡萄球菌慢性感染的實(shí)驗(yàn)研究：在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上建立全新的兔膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后慢性感染的模型，測(cè)定白細(xì)胞、C-反應(yīng)蛋白、病理學(xué)檢查、掃描電鏡觀察和激光共聚焦掃描檢查，研究PLGA/RIP緩釋微球在體內(nèi)預(yù)防表皮葡萄球菌造成的兔膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后慢性感染的效果。 結(jié)果： 1、P

6、LGA/RIP緩釋微球的構(gòu)建和體外洗提學(xué)研究：采用固相合成的方法可以合成得到穩(wěn)定的RIP，經(jīng)反相高效液相法純化可得到純度為96.8％的多肽，通過(guò)質(zhì)譜分析、氨基酸組成分析、氨基酸序列分析、傅立葉紅外光譜分析顯示本研究中合成的RIP具有和天然RIP相同的氨基酸組成乖序列結(jié)構(gòu)。采用改良復(fù)乳-溶劑揮發(fā)法制備的PLGA/RIP緩釋微球粒徑均勻、表面光滑，包封率約為(68.22±6.20)％，載藥率為(15.35±3.26)％．PLGA/RIP前1

7、2小時(shí)釋藥動(dòng)力學(xué)方程為y=3.8507x+10.193，30天累積釋藥動(dòng)力學(xué)方程為y=31.016x+59.611，均符合Huguchi方程，是較為理想的緩釋載藥體系．體外抑菌實(shí)驗(yàn)表明PLGA/RIP緩釋微球具有抑菌活性。 2、PLGA/RIP緩釋微球的血液相容性和組織相容性研究：溶血實(shí)驗(yàn)、凝血實(shí)驗(yàn)和血小板聚集實(shí)驗(yàn)，凝血酶原時(shí)間和活化部分凝血酶時(shí)間測(cè)定證實(shí)了PLGA/RIP緩釋微球?qū)ν玫娜苎?。凝血時(shí)間、血小板聚集以及白細(xì)胞、紅細(xì)

8、胞和血小板地?cái)?shù)量均無(wú)明顯影響，具有良好的血液相容性；急性毒性試驗(yàn)、MTT細(xì)胞毒性試驗(yàn)、肌肉內(nèi)植入試驗(yàn)、過(guò)敏試驗(yàn)及熱原試驗(yàn)證實(shí)了PLGA/RIP緩釋微球不引起全身毒性反應(yīng)，無(wú)細(xì)胞毒性，未見(jiàn)免疫排斥，不引起過(guò)敏反應(yīng)，無(wú)熱源性，具有良好的組織相容性和安全性。 3、PLGA/RIP緩釋微球預(yù)防兔膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后葡萄球菌慢性感染的實(shí)驗(yàn)研究：通過(guò)白細(xì)胞計(jì)數(shù)、C-反應(yīng)蛋白、病理學(xué)檢查、熒光顯微鏡、掃描電鏡和激光共聚焦掃描證實(shí)，術(shù)后兔膝關(guān)節(jié)每天注

9、入1×102CFU的表皮葡萄球菌ATCC35984菌液0.25mL最終會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)生慢性感染，而PLGA/RIP緩釋微球在局部持續(xù)釋放，可以預(yù)防持續(xù)存在的小劑量致病菌造成的兔膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后慢性感染。 結(jié)論： 采用固相合成法和反相高效液相色譜法可以制備高純度的RIP，合成的RIP具有與天然RIP相同的結(jié)構(gòu)組成和抑菌活性；采用改良復(fù)乳-溶劑揮發(fā)法制備的PLGA/RIP緩釋微球粒徑均勻、表面光滑，包封率和載藥率較高，體外釋