IFN-γ介導(dǎo)T細(xì)胞參與炎性痛慢性化機制的研究.pdf

1、目的：病理性疼痛（又稱為慢性痛）已經(jīng)成為全球最大疾病負(fù)擔(dān)，炎性痛是臨床病理性疼痛的主要類型之一。既往研究發(fā)現(xiàn)，在組織損傷或炎癥發(fā)生后，脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞合成、釋放多種促炎細(xì)胞因子、趨化因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子等，彼此相互影響，構(gòu)成局部炎癥微環(huán)境，最終增強興奮性突觸傳遞，即中樞敏化的形成，機體出現(xiàn)痛覺過敏和痛覺異常，但中樞敏化的長期維持或疼痛慢性化的關(guān)鍵機制仍不清楚。
　　近年來研究表明T細(xì)胞與神經(jīng)病理性疼痛的慢性化相關(guān)。至于具

2、體的T細(xì)胞亞型，現(xiàn)有證據(jù)趨向于Th1細(xì)胞，而Th17細(xì)胞的貢獻還有待進一步研究。T細(xì)胞調(diào)控疼痛具體的分子作用機制，以及它們對炎性痛的發(fā)生、發(fā)展是否有影響及作用機制目前研究較少。
　　外周血T細(xì)胞參與脊髓對病理性疼痛的調(diào)控，就必須向由外周向脊髓募集，需要通過血-中樞神經(jīng)系統(tǒng)屏障進入脊髓。炎性損傷發(fā)生后，脊髓膠質(zhì)細(xì)胞激活產(chǎn)生的多種炎癥因子如TNF-α、IL-1β、CCL2等可能會增加血-中樞神經(jīng)系統(tǒng)屏障的通透性，提高對外周免疫細(xì)胞的趨

3、化作用，其中星形膠質(zhì)細(xì)胞更是參與了血-中樞神經(jīng)系統(tǒng)屏障的構(gòu)成。此外有研究發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞在炎癥等適宜刺激下可上調(diào)表達MHC-Ⅱ類分子，可能是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抗原遞呈細(xì)胞。據(jù)此我們推測T細(xì)胞能夠浸潤至脊髓發(fā)揮免疫效應(yīng)，參與炎性痛的維持，而膠質(zhì)細(xì)胞的活化尤其是星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化可能為此提供了必要條件。
　　方法：為驗證以上推測，本課題利用單關(guān)節(jié)炎大鼠炎性痛模型和原代星形膠質(zhì)細(xì)胞，運用免疫熒光組織化學(xué)方法、流式細(xì)胞術(shù)、蛋白質(zhì)免

4、疫印跡等實驗方法，依以下步驟初步探討T細(xì)胞對炎性痛的貢獻、分子機制，以及膠質(zhì)細(xì)胞對它的調(diào)節(jié)作用。
　　一、觀察單關(guān)節(jié)炎大鼠脊髓腰膨大中T細(xì)胞數(shù)量及膠質(zhì)細(xì)胞活化情況建立單關(guān)節(jié)炎大鼠(monoarthritis rats，MA)炎性痛模型，分離MA組和假手術(shù)組大鼠致炎后第7d、10d的脊髓腰膨大，檢測T細(xì)胞數(shù)量、分布位置及活化情況，同時檢測小膠質(zhì)細(xì)胞離子型鈣結(jié)合受體分子-1(Ionized calcium-binding adapto

5、rmolecule-1，Iba1)和星形膠質(zhì)細(xì)胞膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein，GFAP)的表達水平，觀察與比較T細(xì)胞數(shù)量與膠質(zhì)細(xì)胞活化的動態(tài)變化。
　　二、分析探討脊髓膠質(zhì)細(xì)胞的活化狀態(tài)與脊髓T細(xì)胞數(shù)量及活性的關(guān)系建立MA模型，通過藥理學(xué)手段抑制小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，檢測機械縮腿反應(yīng)閾值(Paw withdrawal threshold，PWT)，以及脊髓腰膨大中T細(xì)胞

6、數(shù)量及IFN-γ的表達水平，初步探討膠質(zhì)細(xì)胞活化對T細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。
　　三、分析探討炎性痛大鼠脊髓IFN-γ表達與星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的相關(guān)性通過藥理學(xué)手段改變MA及naive組大鼠脊髓IFN-γ的表達水平后檢測PWT，以及星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP的表達水平。并進一步檢測經(jīng)IFN-γ孵育后的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞中NF-κBp65的磷酸化水平，明確IFN-γ對星形膠質(zhì)細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。
　　結(jié)果：
　　一、單關(guān)節(jié)炎大鼠脊髓腰膨大中T

7、細(xì)胞數(shù)量及膠質(zhì)細(xì)胞活化情況致炎后脊髓T細(xì)胞浸潤及膠質(zhì)細(xì)胞活化:脊髓腰膨大中的T細(xì)胞數(shù)目在致炎后第7d、10d明顯增加，并且在第10d增加更顯著。T細(xì)胞主要分布在脊髓背角。IFN-γ主要與T細(xì)胞標(biāo)記CD3共標(biāo)，而Th17標(biāo)志性細(xì)胞因子IL-17主要與星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記GFAP共標(biāo)。在術(shù)后第7d和第10d，小膠質(zhì)細(xì)胞lba1和星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達水平均上調(diào)，其中Iba1和GFAP分別在第7d、10d上調(diào)更顯著。
　　二、脊髓膠質(zhì)細(xì)胞

8、的活化狀態(tài)與脊髓T細(xì)胞數(shù)量及活性的關(guān)系星形膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié)脊髓T細(xì)胞相關(guān)因子IFN-γ的表達水平:自術(shù)后第3天起經(jīng)鞘內(nèi)多次給藥，與生理鹽水組相比，應(yīng)用小膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑—米諾環(huán)素后大鼠PWT、脊髓T細(xì)胞數(shù)量和IFN-γ的表達水平均無顯著變化;運用星形膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑—氟代檸檬酸后，PWT明顯升高， IFN-γ的表達水平顯著下降，而T細(xì)胞的浸潤數(shù)量無明顯變化。
　　三、炎性痛大鼠脊髓IFN-γ表達與星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的相關(guān)性IFN-γ調(diào)節(jié)疼痛

9、及星形膠質(zhì)細(xì)胞活化:與磷酸鹽緩沖液組相比，鞘內(nèi)連續(xù)給予IFN-γ中和抗體可明顯提高PWT，并下調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP的表達。而naive大鼠經(jīng)鞘內(nèi)給予重組IFN-γ后，與磷酸鹽緩沖液組相比，能夠引起PWT持續(xù)降低，并上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達。體外IFN-γ孵育原代星形膠質(zhì)細(xì)胞可增加星形膠質(zhì)細(xì)胞中NF-κBp65的磷酸化水平。
　　結(jié)論：外周炎癥發(fā)生后，T細(xì)胞可以向脊髓浸潤，并活化分泌IFN-γ;而增加或降低脊髓IFN-γ的表達