慢性乙肝致炎的細(xì)胞分子機(jī)制

1、慢性乙肝致炎的細(xì)胞分子機(jī)制慢性乙肝致炎的細(xì)胞分子機(jī)制孫琳畢惠娟王健摘要：摘要：慢性乙肝是一種由HBV介導(dǎo)的以肝臟局部多種炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的慢性感染性疾病。HBV侵入機(jī)體后能否形成慢性感染與病毒是否變異、宿主抗病毒免疫應(yīng)答強(qiáng)弱等因素密切相關(guān)。免疫耐受、Th1Th2失衡、HBV肝外PBMC感染等是導(dǎo)致乙肝持續(xù)感染遷延難愈的重要原因。機(jī)體對(duì)在清除侵入的病毒時(shí)，可對(duì)受感染的肝細(xì)胞產(chǎn)生一定程度損傷，如CTL通過(guò)分泌穿孔素和表達(dá)Fasl等途徑誘導(dǎo)靶細(xì)胞

2、凋亡；肝臟中嗜中性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生反應(yīng)氧（ROS）、一氧化氮（NO）等反應(yīng)氮等中間產(chǎn)物，介導(dǎo)損傷受感染的肝細(xì)胞，在局部形成以單核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)為主炎性損傷和炎性反應(yīng)。關(guān)鍵詞：關(guān)鍵詞：慢性乙肝；致炎；分子；機(jī)制慢性乙肝是一種由HBV感染引起的以局部單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)為主的感染性疾病。全球約慢性乙肝約有3.5~4億，其中，我國(guó)約有3000萬(wàn)。HBV侵入機(jī)體后，一方面，在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖，產(chǎn)生大量病毒抗

3、原，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，對(duì)全身免疫系統(tǒng)造成很大壓力，致使機(jī)體免疫功能低下。另一方面HBV作為一種抗原，誘導(dǎo)機(jī)體的細(xì)胞免疫反應(yīng)對(duì)其產(chǎn)生免疫清除，此過(guò)程可引起部分肝細(xì)胞損傷，介導(dǎo)局部炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，機(jī)體為保護(hù)肝細(xì)胞不受過(guò)度損傷，肝細(xì)胞自身可表達(dá)一些免疫抑制分子，通過(guò)與相應(yīng)的受體或配體結(jié)合，形成免疫抑制途徑，抑制宿主的抗病毒免疫應(yīng)答，使病毒持續(xù)復(fù)制增殖，病程慢性化。本文圍繞國(guó)內(nèi)外慢性乙肝致炎的細(xì)胞分子機(jī)制研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。1.HBV

4、的結(jié)構(gòu)HBV是一種部分環(huán)化的雙股DNA，由一條較長(zhǎng)且固定的負(fù)鏈(3200bp)和一條較短長(zhǎng)度不定的正鏈(4001900bp)組成，兩鏈的5′末端有長(zhǎng)達(dá)250~300個(gè)互補(bǔ)的堿基，通過(guò)堿基配對(duì)構(gòu)成部分環(huán)化的雙股DNA結(jié)構(gòu)。1970年Dane′s通過(guò)電鏡從澳大利亞土著人血液中發(fā)現(xiàn)了完整的乙肝病毒顆粒，2009年Kamili等[1]以免疫電鏡觀察用抗HBs的多克隆抗體處理樣品，發(fā)現(xiàn)還存在22nm絲狀的亞病毒顆粒；1979年Galibert等將

5、HBVDNA負(fù)鏈劃分為4個(gè)開(kāi)放讀碼框(openreadingframeF)，其總長(zhǎng)為4.7kb，分別為S、C、P、X區(qū)。SF長(zhǎng)度為1185bp，有S、PreS1和PreS23個(gè)功能區(qū)，編碼外膜蛋白。S區(qū)定位于nt155833，由678個(gè)核苷酸組成，編碼226個(gè)氨基酸的S蛋白，主要是小蛋白（SmallproteinSP）或表面抗原，即HBsAg，是HBV疫苗研制的靶點(diǎn)。PreS1基因長(zhǎng)度不定，定位于nt28483204，編碼119個(gè)氨基酸

6、殘基，是HBV與肝細(xì)胞膜直接結(jié)合位點(diǎn)[2]。董菁等[3]應(yīng)用長(zhǎng)距離精確PCR技術(shù)（LAPCR）研究發(fā)現(xiàn)在PreS1區(qū)之前還存在一個(gè)F，暫命名為前前SF，長(zhǎng)度135bp，編碼45個(gè)氨基酸。PreS2基因長(zhǎng)度固定，定位于nt3205154，編碼55個(gè)氨基酸外膜蛋白，具有很強(qiáng)的免疫原性，其120~145位氨基酸殘基是HBV的重要免疫原性決定區(qū)，可誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生，研究證實(shí)PreS2蛋白含有聚合人血清白蛋白（PHSA）受體，肝細(xì)胞表面也存在P

7、HSAR，這樣HBV顆?？赏ㄟ^(guò)PHSA與肝細(xì)胞膜結(jié)合，從而介導(dǎo)HBV入侵肝細(xì)胞，成為HBV侵入肝細(xì)胞的主要途徑[4]。CF分為C區(qū)和前C區(qū)，分別編碼183185個(gè)氨基酸的多肽即HBcAg、29個(gè)氨基酸的殘基和核衣殼蛋白HBeAg。HBcAg和HBeAg是由同一基因編碼，序列大部分相同，都是抗病毒免疫的重要靶位。前C區(qū)極易發(fā)生突變，可造成HBeAg的分泌水平下降或終止。P區(qū)是HBVDNA序列中最長(zhǎng)的F，與S、C、X基因均有重疊，編碼P蛋白

8、，是病毒復(fù)制的主要功能單位。P區(qū)包括4個(gè)編碼區(qū)域，從氨基端開(kāi)始分別為：①末端蛋白區(qū)(TP)，逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中與負(fù)鏈DNA5′端結(jié)合，引導(dǎo)HBV負(fù)鏈的合成。②間隔區(qū)(SD)，該區(qū)耐受突變。③逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)(RT)，該蛋白同時(shí)具有依賴RNA的RNA聚合酶活性和依賴RNA的DNA聚合酶活性。④核糖核酸酶(RNase)H區(qū)，它可裂解逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中形成的RNADNA雜交體中的RNA。X區(qū)位于C區(qū)的上游，是病毒基因中最小的F，其編碼含145~154個(gè)氨基酸的

9、蛋白質(zhì)HBx。Yang等[5]對(duì)研究發(fā)現(xiàn)在HBV基因組中存在PreX基因，將HBV基因通過(guò)PCR法擴(kuò)增并轉(zhuǎn)載至質(zhì)粒中進(jìn)行克隆全基因組序列分析，發(fā)現(xiàn)60%的HBV基因編譯PreX蛋白，PreX蛋白可通過(guò)反式激活病毒增強(qiáng)子Ⅰ促進(jìn)HBV的復(fù)制，HBx還可激活DNA合成從而促進(jìn)靜止的成纖維細(xì)胞增殖。2.HBV的復(fù)制HBV病毒通過(guò)特異性受體結(jié)合至宿主細(xì)胞膜后，通過(guò)吞飲或融合的方式穿入細(xì)胞膜，脫去蛋白質(zhì)衣殼，將病毒DNA基因組釋放入細(xì)胞核，在細(xì)胞D

10、NA聚合酶和RNA聚合酶的作用下形成共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（covalentclosedcircularDNAcccDNA），其作為HBV復(fù)制的原始模板，轉(zhuǎn)錄成為各種不同分子量的mRNA，主要有3.5KbmRNA、2.4KbmRNA、2.1KbmRNA及0.7KbmRNA（Fig2）。3.5KbmRNA稱為HBV前基因組，它可以作為HBVDNA的模板，由P蛋白逆轉(zhuǎn)錄成全長(zhǎng)的HBVDNA負(fù)鏈，病毒以新合成的負(fù)鏈DNA為模板，自DR區(qū)開(kāi)始復(fù)制互

11、補(bǔ)的正鏈DNA，兩者結(jié)合成不完全環(huán)狀雙鏈DNA即HBVrcDNA。新基金項(xiàng)目：基金項(xiàng)目：安徽省自然科學(xué)基金（No:090413138），安徽省教育廳自然基金重點(diǎn)項(xiàng)目（No:KJ2009A032、KJ2007A019）作者單位：作者單位：安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院婦產(chǎn)科護(hù)理學(xué)教研室淮南232001作者簡(jiǎn)介：作者簡(jiǎn)介：孫琳（1964），女，副主任醫(yī)師，發(fā)表論文10余篇，獲市級(jí)科技進(jìn)步獎(jiǎng)1項(xiàng)。研究方向：HBV垂直傳播與免疫。序列，但是兩者的二級(jí)結(jié)構(gòu)不

12、同，各有特異的抗原決定簇。HBcAg是一種顆粒性細(xì)胞內(nèi)抗原，不能通過(guò)胎盤(pán)，但HBeAg作為一種非顆粒性分泌型小分子蛋白，能通過(guò)胎盤(pán)分泌入血，經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)胸腺。Song等[8]在臍帶血中測(cè)得HBeAg陽(yáng)性率為56.9%而有的研究更是高達(dá)88%。由于抗原提呈細(xì)胞功能缺陷，導(dǎo)致主要組織相容性復(fù)合物HLAⅡ限制的HBeAg特異性Th細(xì)胞功能缺失，表現(xiàn)為HBeAg特異性T細(xì)胞耐受，由于兩者在T細(xì)胞識(shí)別水平上有交叉反應(yīng)性，又表現(xiàn)為HBcAg的免疫

13、耐受，HBeAgHBcAg特異性Th耐受可阻止抗HBe和抗HBc的產(chǎn)生，削弱了細(xì)胞毒性T細(xì)胞的應(yīng)答能力，導(dǎo)致病毒的持續(xù)感染，此可能是導(dǎo)致HBsAg、HBeAg陽(yáng)性母親所產(chǎn)新生兒高感染率及慢性化的主要原因。有研究表明，CTL可刺激T細(xì)胞受體TCRCD3復(fù)合物，誘導(dǎo)自身Fas及其配體、腫瘤壞死因子及其受體等凋亡效應(yīng)因子的表達(dá)，通過(guò)受體配體和細(xì)胞內(nèi)凋亡信號(hào)傳遞，誘導(dǎo)T細(xì)胞自身凋亡。宿主感染HBV后，若病毒抗原滴度較高，TCRCD3復(fù)合物所致的

14、刺激就較強(qiáng)，使特異性CTL產(chǎn)生活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(activationinducedcelldeathAICD)，致“克隆衰竭”或在高濃度的包膜抗原作用下處于麻痹狀態(tài)，導(dǎo)致感染慢性化[9]。近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)Th1Th2失衡可能是HBV感染慢性化的重要機(jī)制。1986年Mosmann等首次通過(guò)小鼠T細(xì)胞克隆性分析將Th細(xì)胞（CD4T細(xì)胞）分為Th1、Th2兩個(gè)功能不同的亞群。目前研究可知Th0細(xì)胞在IL12的作用下分化為Th1細(xì)胞，在IL

15、4作用下分化為Th2細(xì)胞。Th1、Th2亞群分別產(chǎn)生不同的細(xì)胞因子，Th1細(xì)胞以分泌IL2、IL12、IFNγ和TNFβ為主，主要參與細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)及細(xì)胞毒作用，并在抵御病毒等細(xì)胞內(nèi)致病因子方面起重要作用。因此Th1細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)，細(xì)胞免疫加強(qiáng)，肝臟的炎癥反應(yīng)較強(qiáng)烈，有利于HBV清除，傾向于發(fā)生急性自限性感染；Th2細(xì)胞則以分泌IL4、IL5、IL6、IL10等為主，主要介導(dǎo)機(jī)體的體液免疫反應(yīng)，在抵御細(xì)胞外致病因子方面發(fā)揮作用，Th2細(xì)

16、胞占優(yōu)勢(shì)，機(jī)體清除病毒的能力下降，傾向于發(fā)生HBV感染的持續(xù)慢性化。越來(lái)越多的研究表明，Th1Th2失衡在機(jī)體免疫應(yīng)答平衡中起著關(guān)鍵作用。病毒性肝炎的進(jìn)展、預(yù)后與宿主免疫功能狀態(tài)密切相關(guān)，Th1Th2失衡與HBV感染后的轉(zhuǎn)歸有著密切的關(guān)系。Akpolat等[10]應(yīng)用ELISA方法測(cè)CHB患者血清中的TNFα、IL4、TGFβ1水平均較對(duì)照組(肝臟的生物化學(xué)水平維持在正常水平)水平高，而IFNγ水平較對(duì)照組的水平低，并進(jìn)一步證實(shí)IL4、

17、IFNγ在HBV的慢性化進(jìn)程中發(fā)揮重要的作用。慢性乙肝患者體內(nèi)存在著細(xì)胞免疫功能的紊亂，HBV感染致機(jī)體Th1Th2比例失衡，使HBV感染慢性化。外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheralbloodmononuclearcellsPBMC）富含各種免疫活性細(xì)胞，是免疫細(xì)胞的集合體，主要為T淋巴細(xì)胞，其在機(jī)體的免疫應(yīng)答中極為重要。有研究顯示，HBV除對(duì)肝細(xì)胞具有高度親和性外，還可侵犯PBMC以及淋巴結(jié)、脾等免疫活性組織細(xì)胞[1114]，并表達(dá)

18、病毒抗原，被特異性CTL識(shí)別并殺傷，未被感染的T細(xì)胞也可和可溶性HBV抗原結(jié)合而被特異性CTL識(shí)別和破壞，導(dǎo)致抗原的提呈功能減弱，相關(guān)抗體及免疫活化分子產(chǎn)生不足，導(dǎo)致HBV感染慢性化。2008年，王健等[15]用PCR的方法對(duì)157例乙肝患者PBMC內(nèi)HBVDNA進(jìn)行檢測(cè)，并采用BSA系統(tǒng)平行檢測(cè)其CD3、CD4、CD8、CD4CD8和mIL2R表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)CD3、CD4水平較正常對(duì)照組顯著下降，CD8水平增高，二者比值下降，表明乙肝

19、患者體內(nèi)存在明顯細(xì)胞免疫功能低下，與免疫細(xì)胞受到HBV的感染密切相關(guān)。4.2HBV免疫逃避策略機(jī)體的某些組織、器官存在一些生理性內(nèi)皮屏障，導(dǎo)致HBV感染淋巴細(xì)胞無(wú)法到達(dá)組織或細(xì)胞不表達(dá)MHC類分子而無(wú)法參與免疫應(yīng)答而逃避宿主免疫性清除。研究表明，這些組織主要包括腎、胰腺、腦以及一些內(nèi)分泌組織如睪丸、卵巢、腎上腺等，由于微血管屏障的存在，HBsAg特異性CTL不能到達(dá)HBsAg陽(yáng)性的實(shí)質(zhì)細(xì)胞部位，從而逃避機(jī)體的免疫，但是它提供了一個(gè)潛在的

20、病毒庫(kù)，通過(guò)持續(xù)釋放病毒，反復(fù)感染肝細(xì)胞等導(dǎo)致感染慢性化。HBV基因組各個(gè)區(qū)段都可發(fā)生變異。當(dāng)病毒侵入人體后，在各種選擇性壓力作用下可發(fā)生變異來(lái)逃避機(jī)體的免疫攻擊。這些變異的HBVDNA可引起病毒復(fù)制和表達(dá)能力下降，使機(jī)體免疫細(xì)胞識(shí)別的抗原減少或缺失，從而逃脫宿主的免疫監(jiān)視。變異的HBV病毒抗原與HLA或TCR結(jié)合活性下降或者變異抗原與HLA或TCR結(jié)合后使其空間構(gòu)象發(fā)生改變，致使變異抗原不能活化T細(xì)胞，而且占據(jù)TCR結(jié)合位點(diǎn)，產(chǎn)生對(duì)野

21、生型抗原識(shí)別的拮抗作用[16]，從而干擾免疫系統(tǒng)對(duì)HBV抗原的加工、提呈、識(shí)別和T細(xì)胞活化，最終導(dǎo)致T細(xì)胞對(duì)靶抗原的免疫耐受。HBsAg“α”決定簇是HBV各亞型的共同決定簇，具有高度免疫原性和序列保守性，S基因變異多集中在此，最常見(jiàn)的是G145R變異，即突變發(fā)生在145位氨基酸殘基上，由甘氨酸變?yōu)榫彼釓亩饦?gòu)型發(fā)生改變，“α”決定簇結(jié)構(gòu)的變異可導(dǎo)致HBsAg免疫原性、抗原性的改變，使之不能與單克隆抗α抗體及免疫疫苗接種后抗體或恢復(fù)

22、期血清抗體結(jié)合或結(jié)合力下降，導(dǎo)致HBV清除能力下降，形成免疫逃避[17]。Waters等[18]通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證明了G145R突變株的免疫原性及與抗HBs的結(jié)合力均發(fā)生明顯變化。另外S基因的變異還可出現(xiàn)HBsAg陰性的HBV感染。PreC基因是HBV基因組的高變區(qū)。1989年Carman等[19]首次報(bào)道了PreC基因nt1896G→A突變，這種突變是最為常見(jiàn)的，可導(dǎo)致HBeAg合成終止，從而使血清中HBeAg呈陰性。對(duì)于由T細(xì)胞和抗體介