PRRSV核衣殼蛋白抑制IFN-β產(chǎn)生的機(jī)制研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)，又被稱為藍(lán)耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRS Virus，PRRSV)引起的一種危害養(yǎng)豬業(yè)的病毒性傳染病，主要引起母豬的繁殖障礙、公豬的精液品質(zhì)下降、初生仔豬的死亡以及其它年齡豬的呼吸系統(tǒng)疾病。天然免疫是宿主抵抗病毒感染的第一道防線，但在與宿主的共進(jìn)化過程中，病毒往往會(huì)發(fā)展各種機(jī)制抵抗宿主的天然免疫，達(dá)到成

2、功感染的目的。以前的研究表明，PRRSV感染能夠拮抗Ⅰ型干擾素（Interferons，IFNs）的產(chǎn)生，而且PRRSV編碼的多種蛋白，包括非結(jié)構(gòu)蛋白nsp1，nsp2，nsp4，nsp11和結(jié)構(gòu)蛋白N蛋白，具有拮抗干擾素產(chǎn)生的能力，但其分子機(jī)制尚不完全清楚。N蛋白是PRRSV編碼的核衣殼蛋白，也是PRRSV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，在PRRSV的感染、致病和免疫調(diào)節(jié)中扮演著十分重要的作用。本研究針對(duì)PRRSVN蛋白，探討其拮抗IFN-β產(chǎn)生的分

3、子機(jī)制，主要研究內(nèi)容如下:
　　1.超表達(dá)PRRSVN蛋白抑制IFN-β產(chǎn)生和IRF3激活
　　將PRRSVN蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，在仙臺(tái)病毒(SeV)的刺激下，采用IFN-β啟動(dòng)子的雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測IFN-β的產(chǎn)生，發(fā)現(xiàn)超表達(dá)PRRSV N蛋白顯著抑制IFN-β的啟動(dòng)子激活。IRF3是干擾素信號(hào)通路中最關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，我們采用同樣的策略分析了N蛋白對(duì)IRF3的影響，發(fā)現(xiàn)超表達(dá)N蛋白也顯著抑制IRF

4、3激活，并且呈劑量依賴性。
　　2.PRRSV N蛋白作用于RIG-Ⅰ/MDA5信號(hào)通路的靶點(diǎn)分析
　　RIG-Ⅰ/MDA5信號(hào)通路在RNA病毒激活干擾素產(chǎn)生中具有十分重要的作用。為了研究PRRSV N蛋白是否拮抗RIG-Ⅰ/MDA5信號(hào)通路以及其作用的靶點(diǎn)，通過共轉(zhuǎn)染PRRSV N蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒和RIG-Ⅰ/MDA5通路中各受體分子(RIG-Ⅰ、MDA5)、接頭蛋白(IPS-1)、蛋白激酶(TBK-1、IKKε)和轉(zhuǎn)錄

5、因子（IRF3）的真核表達(dá)質(zhì)粒，利用雙熒光素酶系統(tǒng)檢測IFN-β的啟動(dòng)子活性。結(jié)果表明，PRRSV N蛋白可以拮抗RIG-Ⅰ、MDA5、IPS-1、TBK-1、IKKε和IRF3介導(dǎo)的IFN-β啟動(dòng)子激活。更重要的是，PRRSVN蛋白還可以拮抗IRF3顯性突變體IRF3-5D介導(dǎo)的IFN-β啟動(dòng)子激活，提示PRRSV作用RIG-Ⅰ/MDA5通路的靶點(diǎn)在IRF3或IRF3下游。通過間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析了N蛋白的亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)PRR

6、SV N蛋白呈現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核穿梭分布，表明其具有在細(xì)胞核內(nèi)靶向IRF3的可能。
　　3.PRRSV N蛋白抑制IFN-β產(chǎn)生的關(guān)鍵功能域分析
　　為了確定PRRSVN蛋白抑制IFN-β產(chǎn)生的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，通過IFN-β啟動(dòng)子的雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，分別檢測了N蛋白的不同區(qū)域缺失突變體（6個(gè)N-端缺失突變體和5個(gè)C-端缺失突變體）抑制IFN-β產(chǎn)生的能力。結(jié)果顯示:PRRSV N蛋白的aa37-57和aa69-123是抑制SeV