調(diào)控IFN-γ的microRNA篩選及作用機(jī)制研究.pdf

1、免疫系統(tǒng)是生物體抵抗外來(lái)微生物入侵的第一道防線，干擾素是免疫應(yīng)答過(guò)程中的重要效應(yīng)因子。Interferon-γ(IFN-γ)屬于Ⅱ型干擾素，主要由活化的T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞產(chǎn)生，在天然免疫和獲得性免疫中發(fā)揮重要作用，特別是對(duì)胞內(nèi)寄生菌的感染具有顯著抑制效果。microRNA(miRNA)是一類(lèi)廣泛存在于生物體內(nèi)且長(zhǎng)度在18-25bp之間的非編碼RNA。近十年來(lái)，大量研究表明miRNA參與對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的調(diào)控，對(duì)維持機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài)起著舉足

2、輕重的作用。本研究選取重要的免疫細(xì)胞因子IFN-γ作為研究對(duì)象，利用生物信息學(xué)方法和生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，對(duì)可能參與調(diào)控IFN-γ表達(dá)的miRNA進(jìn)行了篩選和驗(yàn)證，希望通過(guò)本研究能夠系統(tǒng)闡述miRNA對(duì)IFN-γ表達(dá)多層次的調(diào)控機(jī)制，加深對(duì)miRNA調(diào)控IFN-γ介導(dǎo)的免疫應(yīng)答過(guò)程中作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)，同時(shí)為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)miRNA作為疾病診斷和治療的新靶標(biāo)提供理論依據(jù)。具體研究?jī)?nèi)容包括以下幾個(gè)方面:
　　1.靶向IFN-γ啟動(dòng)子及其3'UTR的m

3、iRNA的預(yù)測(cè)
　　利用在線miRNA預(yù)測(cè)軟件Microinspector和TargetScan分別對(duì)IFN-γ轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的1197bp序列及3'UTR的583bp序列進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)到可能靶向IFN-γ啟動(dòng)子區(qū)域的miRNA50條，可能靶向IFN-γ3'UTR的miRNA11條。根據(jù)miRBase公布的miRNA序列信息，從預(yù)測(cè)結(jié)果中選取8條可能靶向IFN-γ啟動(dòng)子區(qū)域的miRNA和10條可能靶向3'UTR的miRNA合成m

4、imics及inhibitors。
　　2.報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建
　　將PCR擴(kuò)增獲得的IFN-γ轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的1197bp片段和3'UTR的583bp片段分別連接到pGL3-Basic和pMIR-REPORT載體上，成功構(gòu)建了IFN-γ啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒pGL3-TSS1197和3'UTR報(bào)告質(zhì)粒pMIR-IFNG-3'UTR。
　　3.調(diào)控IFN-γ表達(dá)的miRNA的篩選及驗(yàn)證
　　將合成的miRNAmimics分

5、別與IFN-γ啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒pGL3-TSS1197共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)篩選到能抑制IFN-γ啟動(dòng)子活性的miR-27a。同時(shí)將合成的miRNAmimics分別與IFN-γ3'UTR報(bào)告質(zhì)粒pMIR-IFNG-3'UTR共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)篩選到miR-27a能夠與IFN-γ3'UTR結(jié)合并具有負(fù)調(diào)控作用，并利用miRNAinhibitors對(duì)miR-27a的負(fù)調(diào)控作用進(jìn)行了驗(yàn)

6、證。進(jìn)一步利用相應(yīng)靶點(diǎn)突變報(bào)告質(zhì)粒，確定了miR-27a結(jié)合IFN-γ啟動(dòng)子及3'UTR的靶點(diǎn)。
　　4.miR-27a抑制T細(xì)胞中IFN-γ表達(dá)
　　為了進(jìn)一步在T細(xì)胞中探究miR-27a對(duì)IFN-γ表達(dá)的影響，將T-bet表達(dá)質(zhì)粒和miR-27amimics電轉(zhuǎn)EL4細(xì)胞，并用適量濃度的PMA和ionomycin刺激，24h后收集樣品并利用Real-TimePCR和ELISA分別檢測(cè)IFN-γmRNA和蛋白的表達(dá)水平。結(jié)

7、果miR-27a能顯著下調(diào)EL4細(xì)胞中IFN-γmRNA和蛋白的表達(dá)，說(shuō)明在T細(xì)胞中miR-27a對(duì)IFN-γ的表達(dá)具有負(fù)調(diào)控功能。
　　5.IFN-γ表達(dá)與miR-27a表達(dá)之間的關(guān)系
　　為了更深入的闡明miR-27a在調(diào)控IFN-γ表達(dá)中的作用，我們分析了IFN-γ的表達(dá)與miR-27a表達(dá)之間的關(guān)系。加入PMA和ionomycin誘導(dǎo)EL4細(xì)胞中IFN-γ表達(dá)，并分別于刺激后6h、12h、18h、24h檢測(cè)miR-2