傷害性初級傳入的突觸前及突觸后NMDA受體介導(dǎo)慢性痛敏化的分子機(jī)制研究.pdf

1、近年來,慢性痛的機(jī)制研究取得了長足的進(jìn)展,大量的受體、通道、激酶系統(tǒng)在慢性痛的發(fā)生、發(fā)展中的作用逐漸被揭示。炎癥或損傷后感覺神經(jīng)元第一級突觸的谷氨酸能突觸的功能性變化在慢性痛的發(fā)展和維持中起關(guān)鍵作用。在慢性疼痛中樞敏化的過程中,NMDA受體同樣發(fā)揮著重要的作用。免疫組織化學(xué)研究顯示NMDA受體廣泛表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸后神經(jīng)元上,同時(shí)大量的研究表明,NMDA受體也同時(shí)表達(dá)在突觸前終末以及背根節(jié)(dorsal root ganglion,

2、DRG)神經(jīng)元上。DRG位于外周神經(jīng)系統(tǒng),位于其內(nèi)的中、小型神經(jīng)元,包括其胞體及中樞突和外周突的A和C纖維,主要負(fù)責(zé)感受和傳遞痛覺信息,因此又被稱為痛感受器或傷害性感受器(nociceptor)。由于這些受體可被痛感受器自身釋放的谷氨酸所激活,所以又被稱為痛感受器的自身受體或自受體(autoreceptor)。脊髓背角突觸前終末釋放谷氨酸可被多種因素影響,其中激活I(lǐng)類促代謝型谷氨酸受體、P2X3受體會(huì)導(dǎo)致突觸前末梢釋放谷氨酸增加,而激活

3、μ-阿片受體、α2腎上腺素能受體、CB1大麻素受體、GABAB受體以及II類和III類促代謝型谷氨酸受體都可以導(dǎo)致突觸前谷氨酸釋放的降低。谷氨酸能突觸的功能主要能被三個(gè)因素影響:
　　①突觸前谷氨酸能神經(jīng)元釋放的谷氨酸量;
　?、谶M(jìn)入突觸間隙中谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體攝取谷氨酸的比率;
　?、弁挥|后膜上功能性谷氨酸受體的數(shù)量。
　　在其他神經(jīng)系統(tǒng)的研究表明,突觸前NMDA受體可以調(diào)節(jié)海馬、小腦等部位的突觸遞質(zhì)釋放。Bardo

4、niet等在正常動(dòng)物的脊髓薄片標(biāo)本上的研究表明,激活外周傳入末梢的突觸前NMDA受體,可以抑制脊髓背角eEPSC的幅值,延長eEPSC的潛伏期;進(jìn)一步表明突觸前NMDA受體的激活可以抑制脊髓背角Lamina II神經(jīng)元的突觸傳遞,這一結(jié)果提示突觸前的NMDA自身受體可能對痛覺信息的傳入產(chǎn)生負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。因此,突觸前末梢釋放的谷氨酸可直接作用于突觸前的NMDA受體,產(chǎn)生復(fù)雜多樣的作用。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為其最主要功能是作為負(fù)反饋抑制突觸前遞質(zhì)的

5、釋放,從而防止突觸間隙的遞質(zhì)濃度過高。
　　前期研究表明,激活嗎啡耐受大鼠的突觸前NMDA受體可以增強(qiáng)突觸前末梢谷氨酸的釋放。在癲癇動(dòng)物模型上,激活前腦突觸前NMDA受體也可以導(dǎo)致突觸前末梢谷氨酸的釋放增加。免疫組織化學(xué)和免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在損傷或炎癥誘發(fā)的慢性痛狀態(tài)下,痛感受器NMDA自身受體的表達(dá)水平明顯升高。功能學(xué)研究結(jié)果顯示慢性痛狀態(tài)下痛感受器NMDA自身受體的功能活動(dòng)呈現(xiàn)明顯增強(qiáng),例如,實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎誘發(fā)痛感受器NMDA

6、自身受體的磷酸化水平顯著升高、NMDA誘發(fā)的內(nèi)向電流幅度和細(xì)胞內(nèi)鈣濃度明顯上升。這些研究結(jié)果均提示慢性痛狀態(tài)下,痛感受器NMDA自身受體的功能狀態(tài)顯著增強(qiáng)。鞘內(nèi)注射NMDA激活突觸前NMDA受體可以導(dǎo)致外周終末釋放P物質(zhì)。Yan等發(fā)現(xiàn),在外周損傷的情況下,突觸前NMDA受體活動(dòng)的增強(qiáng)則可以提高突觸前谷氨酸的釋放。在病理狀態(tài)下,已有的行為學(xué)研究顯示,局部注入NMDA受體拮抗劑對炎癥或損傷誘致的痛過敏和神經(jīng)元放電增強(qiáng)具有顯著的抑制作用而非增

7、強(qiáng)作用。這些結(jié)果提示在炎癥或損傷的情況下,突觸前NMDA受體可能發(fā)生了活動(dòng)依賴性改變,即在脊髓淺層由生理狀態(tài)轉(zhuǎn)為炎癥病理狀態(tài)時(shí),突觸前NMDA受體對突觸傳遞的抑制效應(yīng)轉(zhuǎn)變成興奮效應(yīng)。盡管上述結(jié)果提示外周部位的NMDA受體可能在病理狀態(tài)下具有致痛敏作用,但這些結(jié)果均來自于外周局部注入NMDA受體拮抗劑,而這些拮抗劑的特異性、作用時(shí)程以及確切的作用靶點(diǎn)都難以確定,因此上述結(jié)果還不能確切揭示痛感受器NMDA自身受體在病理狀態(tài)下的具體作用及功能

8、。綜上所述,為了特異性地揭示痛感受器NMDA自身受體是否在慢性病理性痛中發(fā)揮著致痛敏作用,我們應(yīng)用Cre-loxP技術(shù)在痛感受器上建立了條件性敲除NMDA自身受體的必需組分——功能亞單位NR1基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型,即特異性地剔除痛感受器NMDA自身受體的正常結(jié)構(gòu)和功能,而保留中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及非神經(jīng)系統(tǒng)的NMDA受體結(jié)構(gòu)和功能完整。
　　本研究在痛感受器上建立了條件性敲除NMDA自身受體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型,進(jìn)一步研究突觸前NMDA受體

9、在生理狀態(tài)以及病理狀態(tài)下對傷害性感受神經(jīng)元第一級突觸的作用,從而研究病理過程中的突觸前NMDA受體的活動(dòng)依賴性改變,為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)NMDA受體的作用和功能奠定基礎(chǔ)。
　　有研究表明脊髓背角淺層的突觸后神經(jīng)元上的離子通道變化在慢性痛的中樞敏化過程中發(fā)揮重要作用。突觸后神經(jīng)元內(nèi)Ca2+濃度的動(dòng)態(tài)變化可以編碼突觸前后神經(jīng)元的動(dòng)作電位時(shí)序,進(jìn)而啟動(dòng)引起突觸傳遞效率改變的胞內(nèi)過程。一般認(rèn)為,重復(fù)在EPSP之后刺激突觸后神經(jīng)元產(chǎn)生動(dòng)作電位可以高

10、度激活突觸后NMDA受體,產(chǎn)生大幅度的Ca2+內(nèi)流,激活鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶 II(CaMKII)而導(dǎo)致LTP的產(chǎn)生。因此,突觸后NMDA受體的功能性改變對中樞敏化的產(chǎn)生及發(fā)展起關(guān)鍵性作用。
　　CCL2又稱為單核細(xì)胞趨化因子-1(monocytes chemoattractant protein1,MCP-1),其可以招募單核細(xì)胞到達(dá)炎癥、感染、外傷、局部缺血等部位。大量實(shí)驗(yàn)表明CCL2與疼痛密切相關(guān)。電生理實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在

11、培養(yǎng)DRG神經(jīng)元上充灌CCL2可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加。同時(shí)表現(xiàn)出神經(jīng)病理性痛行為的動(dòng)物DRG神經(jīng)元在給予CCL2后可發(fā)生顯著的去極化。CCL2導(dǎo)致的痛感受器敏化可能是由于其激活了 TRP通道以及抑制了K+電導(dǎo)。Yang等的研究表明,CCL2抑制了一種電壓依賴的不失活的外向流,推測可能是外向整流鉀電流。CCL2通過軸漿運(yùn)輸從DRG輸送到外周神經(jīng)終末,從而在皮內(nèi)注射CCL2也可以直接導(dǎo)致機(jī)械痛敏反應(yīng)的增強(qiáng)。同時(shí)大量的研究表明,外周神經(jīng)

12、損傷后,CCL2可能作為一種神經(jīng)調(diào)制,從外周神經(jīng)到脊髓背角具有活動(dòng)依賴性釋放的特征,即不同的病理?xiàng)l件可以通過調(diào)節(jié)CCL2的釋放,進(jìn)而影響病理性過程。
　　也有研究表明,CCR2也表達(dá)在脊髓背角神經(jīng)元胞體。但是神經(jīng)元胞體上的CCR2結(jié)合了CCL2后如何發(fā)揮功能尚未見報(bào)道。我們的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),CCL2可以結(jié)合脊髓背角神經(jīng)元上的CCR2,通過進(jìn)一步激活細(xì)胞外信號相關(guān)蛋白激酶(extracellular signal regulated

13、 kinases,ERK)信號通路,從而導(dǎo)致脊髓背角突觸后神經(jīng)元NMDA受體通道功能的上調(diào),進(jìn)而對慢性痛發(fā)揮進(jìn)行調(diào)節(jié),而這種作用主要是通過NR2B亞單位介導(dǎo)的。炎癥條件下,花生四烯酸可以通過Cox酶解產(chǎn)生前列腺素(prostglandin,PG),其中前列腺素E2(PGE2)參與炎癥反應(yīng),并可以刺激外周神經(jīng)末梢引起痛覺敏化,而Cox-2的表達(dá)在炎癥刺激下顯著升高。而抑制Cox-2即可以抑制PGE2。研究表明,在海馬PGE2可以作用于突觸

14、前EP2受體從而導(dǎo)致突觸前谷氨酸釋放的增加。大量研究表明,PGE2可以誘導(dǎo)CCL2/MCP-1的釋放。本研究結(jié)果表明,CCL2誘導(dǎo)的脊髓背角突觸后神經(jīng)元NMDA電流增強(qiáng)的作用不能被Cox-2阻斷劑完全阻斷,因此CCL2可直接作用于神經(jīng)元胞體,通過ERK調(diào)節(jié)NR2B從而導(dǎo)致中樞敏化。
　　第一部分、痛感受器NMDA自身受體的致痛敏作用及其機(jī)制
　　在慢性疼痛的中樞敏化過程中,NMDA受體發(fā)揮著重要的作用。大量結(jié)果提示外周部位的

15、NMDA受體可能在病理狀態(tài)下具有致痛敏作用,但是應(yīng)用拮抗劑進(jìn)行研究具有一定的局限性。目前的研究結(jié)果還不能確切揭示痛感受器NMDA自身受體在病理狀態(tài)下的具體作用及功能,因此我們擬用在痛感受器上條件性敲除NMDA自身受體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型,進(jìn)一步研究突觸前NMDA受體在生理狀態(tài)以及病理狀態(tài)下對傷害性感受神經(jīng)元第一級突觸的作用,旨在研究病理過程中的突觸前NMDA受體的活動(dòng)依賴性改變,為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)NMDA受體的作用和功能奠定基礎(chǔ)。
　　結(jié)果

16、如下:
　　1.建立SNS-NR1-/-小鼠
　　我們應(yīng)用Cre-loxP技術(shù)在痛感受器上建立了條件性敲除NR1亞單位的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。電生理實(shí)驗(yàn)中,灌流給予NMDA可在 NR1fl/fl小鼠中IB4-Fluor488陽性標(biāo)記的傷害性DRG神經(jīng)元上誘致一顯著的內(nèi)向電流,并且對NMDA受體拮抗劑AP5敏感;而NMDA誘發(fā)的內(nèi)向電流在SNS-NR1-/-小鼠中幾乎被完全阻斷,說明在DRG神經(jīng)元上,傷害感受性神經(jīng)元的NMDA受體功

17、能被完全敲除,而其他非傷害性感受神經(jīng)元上的NMDA受體功能未受影響。
　　2.行為學(xué)表型
　　通過行為學(xué)研究發(fā)現(xiàn),NR1fl/fl小鼠與 SNS-NR1-/-小鼠的正常機(jī)械性痛域和熱痛域沒有顯著性差異。在后肢足底皮下注射Capsaicin誘致的急性自發(fā)痛反應(yīng)過程中,NR1fl/fl小鼠與SNS-NR1-/-小鼠在反應(yīng)時(shí)間上也沒有顯著差異。Formalin誘致的第二相持續(xù)性自發(fā)痛反應(yīng)程度在SNS-NR1-/-小鼠中顯著低于野生

18、型小鼠,而后肢足底注射CFA誘致的機(jī)械性痛域和熱痛域則明顯弱于野生型小鼠。
　　3.機(jī)制探討
　　在DRG上應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗記錄神經(jīng)元,用串刺激使神經(jīng)元釋放谷氨酸,在串放電之后可以見到明顯的內(nèi)向電流,并且這個(gè)內(nèi)向電流可以被NMDA受體阻斷劑AP5所阻斷。說明DRG釋放的谷氨酸可以作用于周圍神經(jīng)元或者自身NMDA受體并發(fā)揮功能。
　　NR1fl/fl小鼠與SNS-NR1-/-小鼠的IB4-Fluor488陽性標(biāo)記的傷害性

19、DRG神經(jīng)元靜息膜電位、基強(qiáng)度以及閾值都沒有顯著差異。在CFA足底注射24 h后,NR1fl/fl動(dòng)物神經(jīng)元的靜息膜電位、基強(qiáng)度以及閾值顯著降低,而SNS-NR1-/-動(dòng)物的IB4-Fluor488陽性標(biāo)記的傷害性DRG神經(jīng)元的靜息膜電位、閾值顯著降低,但是基強(qiáng)度無變化。而在對照組中,NR1fl/fl小鼠及SNS-NR1-/-小鼠中DRG神經(jīng)元的靜息膜電位、基強(qiáng)度以及閾值無顯著變化。
　　研究發(fā)現(xiàn),在NR1fl/fl小鼠,IB4-

20、Fluor488陽性標(biāo)記的傷害性DRG神經(jīng)元在采用不同斜率的斜波注入電流引起的神經(jīng)元放電的個(gè)數(shù)在 CFA注射24 h后顯著升高,而在SNS-NR1-/-小鼠IB4-Fluor488陽性標(biāo)記的傷害性DRG神經(jīng)元,CFA足底注射24 h后并無顯著變化。
　　通過電生理實(shí)驗(yàn)給予背根2Hz低頻條件刺激,在 NR1fl/fl小鼠向PAG投射的脊髓背角I層神經(jīng)元上可誘導(dǎo)長時(shí)程增強(qiáng)現(xiàn)象(LTP)。而在特異性敲除突觸前NMDA受體的SNS-NR1

21、-/-小鼠上,向PAG投射的脊髓背角I層神經(jīng)元上的LTP被顯著抑制。
　　第二部分、CCL2對脊髓背角Lamina II突觸后神經(jīng)元NMDA受體的直接作用
　　本文擬對脊髓背角Lamina II神經(jīng)元NMDA受體進(jìn)行檢測,觀察單核細(xì)胞趨化因子-1(MCP-1)對脊髓背角Lamina II神經(jīng)元NMDA受體的作用，進(jìn)一步闡釋炎性致痛敏過程中，激活小膠質(zhì)細(xì)胞以及星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子、趨化因子不僅僅可以通過作用于小膠質(zhì)細(xì)胞本

22、身增強(qiáng)突觸后神經(jīng)元的反應(yīng)性，也可以通過趨化因子直接作用于突觸后神經(jīng)元胞體，從而通過直接調(diào)控突觸后胞體上NMDA受體的表達(dá)來調(diào)控神經(jīng)元的反應(yīng)特性，突觸后NMDA受體的活動(dòng)依賴性改變可以進(jìn)一步引起中樞敏化，造成炎性損傷。
　　結(jié)果如下:
　　1.CCL2誘致動(dòng)物痛行為反應(yīng)增強(qiáng)對11只8wC57BL/6動(dòng)物進(jìn)行行為學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)CCL2可以誘導(dǎo)痛行為增強(qiáng)。給予C57BL/6小鼠單次鞘內(nèi)注射100閃的CCL2可以誘發(fā)炎癥痛敏反應(yīng)，導(dǎo)致縮

23、足反射的潛伏期縮短。應(yīng)用CCL2的天然受體CCR2的拮抗劑RS504393，可以抑制CCL2誘發(fā)的炎性痛敏反應(yīng)。
　　CFA注射1d后，C57BL/6表現(xiàn)出持續(xù)的機(jī)械痛敏及熱痛敏行為學(xué)表型。而腹腔注射RS504393后，CFA導(dǎo)致的機(jī)械痛敏及熱痛敏被顯著地抑制。CFA注射1d后，C57BL/6表現(xiàn)出的持續(xù)機(jī)械痛敏及熱痛敏可以被NR2B的抑制劑Ifenprodil所阻斷。
　　2.炎癥損傷后CCL2和CCR2表達(dá)上調(diào)實(shí)時(shí)定量P

24、CR(Real-time PCR)顯示脊髓的CCR2 mRNA的表達(dá)在CFA導(dǎo)致的炎性痛中明顯上調(diào)。通過Western blot研究發(fā)現(xiàn)CCL2可以顯著增強(qiáng)NR2B的蛋白水平，而腹腔注射RS504393可以減弱這種表達(dá)增強(qiáng)。
　　3.CCL2致痛敏作用的細(xì)胞分子機(jī)制通過在神經(jīng)元上進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)以及單細(xì)胞PCR發(fā)現(xiàn)，5例Lamina II神經(jīng)元上中的4例神經(jīng)元可以誘導(dǎo)出NMDA電流，并且其中的兩例CCL2可增強(qiáng)NMDA誘發(fā)電流

25、，提示NMDA受體與CCR2可共表達(dá);單細(xì)胞PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)可以誘發(fā)NMDA電流的神經(jīng)元同時(shí)也表達(dá)囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體2;表達(dá)囊泡抑制性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的抑制性神經(jīng)元并不能誘發(fā)NMDA電流，提示NMDA受體可能不表達(dá)在抑制性神經(jīng)元上。
　　Westen blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CCL2可以直接增強(qiáng)神經(jīng)元PERK的水平，同時(shí)這種增強(qiáng)作用可以被細(xì)胞內(nèi)加入PERK的阻斷劑PD98059所阻斷，同時(shí)也可被細(xì)胞外加入CCR2抑制劑RS504393所阻斷。<

26、br>　　電生理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步顯示，表面灌流CCL2(100 ng/ml)可以導(dǎo)致NMDA電流的顯著增加，而這種增加可以被CCR2的拮抗劑RS504393所阻斷。同時(shí)發(fā)現(xiàn)CCL2可以增強(qiáng)CFA致炎性痛敏動(dòng)物L(fēng)amina II神經(jīng)元的NMDA電流。突觸的電生理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，表面灌流CCL2/MCP-1 2 min并不能增強(qiáng)AMPAR介導(dǎo)的誘發(fā)興奮性突觸后電流(evoked excitatory postsynaptic current,e

27、EPSC)，但是顯著增強(qiáng)了NMDAR介導(dǎo)的eEPSC。表明CCL2可以直接或者間接作用于突觸后NMDA受體從而引發(fā)突觸后作用。
　　在CFA注射24 h后炎性痛敏動(dòng)物脊髓背角Lamina II神經(jīng)元表面灌流CCR2拮抗劑RS504393可以在短時(shí)間內(nèi)(<2 min)顯著降低NMDA誘發(fā)電流。應(yīng)用NR2B的特異性阻斷劑Ifenprodil，可以部分阻斷脊髓背角Lamina II神經(jīng)元上的NMDA電流，同時(shí)也可以阻斷CCL2對NMDA

28、電流的增強(qiáng)作用。
　　應(yīng)用在體電生理實(shí)驗(yàn)技術(shù)，在麻醉動(dòng)物脊髓背角記錄場電位EPSP(fEPSP)給予強(qiáng)直條件刺激后，可以在脊髓背角誘發(fā)fEPSP的增強(qiáng)，這種增強(qiáng)可以持續(xù)數(shù)小時(shí)。研究發(fā)現(xiàn)，在體脊髓誘發(fā)的LTP可以被RS504393翻轉(zhuǎn)。
　　結(jié)論:1.在生理狀態(tài)下，脊髓背角第一級突觸的突觸前NMDA受體，對傷害性信號的突觸傳遞主要發(fā)揮抑制性調(diào)控作用。
　　2.在慢性炎癥病理狀態(tài)下，脊髓背角第一級突觸的突觸前NMDA受體發(fā)