金銀花藥材指紋圖譜研究

1、1,1,中藥整體質(zhì)量控制的方法研究和趨勢 上海市食品藥品檢驗所季 申2013.04 Address: 1500 Zhang Heng Road, Shanghai 201203, China Email: jishen200

2、8@gmail.com,2,,報告內(nèi)容,整體控制中藥質(zhì)量的必要性應(yīng)用一測多評等技術(shù)的問題和解決方案整體控制中藥質(zhì)量的展望,3,中藥整體質(zhì)量控制的必要性,中藥的特點,值得肯定的是：企業(yè)對產(chǎn)品的安全性的重視，大部分中藥有一定的有效性和安全性，積累了很多的臨床和實踐經(jīng)驗。 中藥如何尋求平衡？中藥的前景？如何研究的思路？,,,中藥成分復(fù)雜難以全面控制全部成分同品種不同生產(chǎn)企業(yè)的生產(chǎn)設(shè)備難以完全一致藥材是天然產(chǎn)

3、品，難以保證質(zhì)量完全一致,思考：,4,中藥整體質(zhì)量控制的必要性,中藥質(zhì)量控制的發(fā)展歷程及趨勢,發(fā)展歷程缺乏專屬性控制指標(biāo)單一成分到多成分的控制指標(biāo)成分到有效成分的控制,面臨的問題中藥成分的復(fù)雜性方法的專屬、可控、實用和經(jīng)濟(jì)有效性與安全性指標(biāo)的合理設(shè)置,發(fā)展趨勢從局部控制到整體控制多成分定量結(jié)合指紋圖譜的全方位中藥質(zhì)控新模式,解決方案物質(zhì)基礎(chǔ)的深入研究實現(xiàn)合理全面的質(zhì)量控制,,中藥整體質(zhì)量控制能夠反映中藥內(nèi)在質(zhì)量的整體

4、變化情況和質(zhì)量的均一程度，確保中藥質(zhì)量的均一穩(wěn)定。,中藥質(zhì)量控制面臨的問題及解決方案,,5,物質(zhì)基礎(chǔ)研究必要性,應(yīng)用一測多評等技術(shù)的問題和解決方案,制約中藥發(fā)展的瓶頸---易導(dǎo)致藥效作用機(jī)理,不良反應(yīng)發(fā)生等機(jī)制闡述不清建立全面可控的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)---建立更科學(xué)、合理、有效的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)中藥技術(shù)提升的關(guān)鍵---更好地闡明中藥作用機(jī)制等問題，促進(jìn)中醫(yī)藥理論創(chuàng)新及新藥的研發(fā),6,,中藥注射液質(zhì)量控制的模式(案例1）,闡明注射液總固體中的

5、成分,,,,,,,,黃芩,金銀花,,方法學(xué)認(rèn)證,,提取物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),注射劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),,明確注射液總固體含有的大類成分和單體成分,,,,,,,,,,山羊角,建立專屬性的分析方法,,,,,熊膽粉,,,連翹,保證中藥注射劑的安全性、穩(wěn)定性、有效性,明確5味提取物的物質(zhì)基礎(chǔ),,,,,,,,,,,,,,有效地控制中藥注射液內(nèi)在的質(zhì)量，運用高效液相色譜法、質(zhì)譜法等技術(shù)手段，將闡明的化學(xué)成分納入質(zhì)量控制體系!,7,,,明確了8個成分 建

6、立了5種成分含量的專屬 性測定方法 5種成分含量約為干燥提取物的98%,,研究方法 研究成果,HPLC法 柱層析分離 Q-TOF液質(zhì) NMR等手段,,黃芩提取物,,8,,,,明確了黃芩提取物中的8個成分,,,,,,1,2,,3,,4,,5,6,7,8,,,黃芩提取物中約98％成分已明確結(jié)構(gòu),基本闡明了黃芩提取物的物質(zhì)基礎(chǔ)。,黃芩提取物的物質(zhì)基礎(chǔ)的研究,,9,,,分離得到4個已知化合物

7、明確了11個化合物結(jié)構(gòu) 有機(jī)酸類成分約為干燥提取物的28 % -39%,,研究方法 研究成果,HPLC（UV) HPLC-氨基柱 高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜HPLC,,金銀花提取物,,10,,,,,金銀花提取物質(zhì)譜總離子流圖,金銀花提取物物質(zhì)基礎(chǔ)的研究,金銀花提取物中有機(jī)酸類成分占28％-39％。,明確了金銀花提取物中的11個成分,11,,,分離得到2個已知化合物 建立12種成分含量測定方法 小

8、分子成分約占提取物10% 黃酮類成分約占提取物44%,,研究方法 研究成果,HPLC –DAD 多波長 HPLC –蒸發(fā)光檢測器 HPLC –離子阱質(zhì)譜 HPLC –QTOF質(zhì)譜 HPLC –示差檢測器 UV,,連翹提取物,,12,,,明確了連翹提取物中的12個成分,,,,1、連翹酯苷E2、連翹酯苷D3、咖啡酸4、組峰（連翹酯苷C及其同分異構(gòu)體）5、連翹酚1

9、（連翹酯苷A 的同分異構(gòu)體）6、蘆丁,7、異連翹酯苷A（連翹酯苷A 的同分異構(gòu)體）8、連翹酯苷A9、suspensaside A的同分異構(gòu)體10、suspensaside A的同分異構(gòu)體11、suspensaside A12、連翹苷,連翹提取物物質(zhì)基礎(chǔ)的研究,小分子成分總量約占干燥提取物近10%。,13,,,,連翹苷（C27H34O11）,蘆丁(C27H30O16),連翹酯苷C及其同分異構(gòu)體（C29H36O16）,suspe

10、nsaside A及其同分異構(gòu)體（C29H34O15）,連翹酚1（C29H36O15）,在藍(lán)圈處咖啡?；〈恢冒l(fā)生互換，或空間上立體構(gòu)型發(fā)生變化，都會產(chǎn)生異構(gòu)體。,14,,,得到31種氨基酸 建立12種氨基酸的檢測方法 蛋白氨基酸約為干燥提取物的70%存在焦谷氨酸,,研究方法 研究成果,高效液相色譜法 高效液相色譜柱前衍生法 液質(zhì)聯(lián)用同位素內(nèi)標(biāo)法 高分辨率質(zhì)譜,,山羊角提取物,,15,,

11、山羊角提取物物質(zhì)基礎(chǔ)的研究,,1、天冬氨酸 2、谷氨酸 3、絲氨酸,4、甘氨酸 5、蘇氨酸 6、丙氨酸,7、纈氨酸 8、苯丙氨酸 9、異亮氨酸,10、亮氨酸 11、脯氨酸,,11種蛋白氨基酸和焦谷氨酸的總量約占注射液總固體量的15%。,焦谷氨酸,,,明確了山羊角提取物中的11個成分,16,,,主要成分為熊去氧膽酸與鵝去氧膽酸 上述兩種成分總量占干燥提取物90％以上,,研究方法

12、 研究成果,紅外 核磁 制備薄層 高分辨率質(zhì)譜 HPLC（UV和 ELSD）,熊膽粉提取物,,17,,熊膽粉提取物,熊膽粉提取物物質(zhì)基礎(chǔ)的研究,注射液,注射液與熊膽粉提取物共有成分為熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸,兩者總量約占注射液總固體量的33%。,熊去氧膽酸,鵝去氧膽酸,熊去氧膽酸,鵝去氧膽酸,18,,國食藥監(jiān)注[2007]743號文件《關(guān)于印發(fā)中藥、天然藥物注射劑基本技術(shù)要求的通知》,總固體的80％成分可

13、測總固體的60％成分明確結(jié)構(gòu)并采用專屬性方法可測明確結(jié)構(gòu)成分中的90％在指紋圖譜中可指認(rèn),技術(shù)要求,19,,注射液物質(zhì)基礎(chǔ)研究結(jié)果,,A：總固體中可測成分B：總固體中明確結(jié)構(gòu)并采用專屬性方法可測成分C：明確結(jié)構(gòu)并可在指紋圖譜中指認(rèn)成分,,闡明的物質(zhì)基礎(chǔ)和質(zhì)量控制已滿足國家的有關(guān)技術(shù)要求,,20,,,注射液指紋圖譜,,,,,,,,,,,,,,,指紋圖譜1,指紋圖譜2,1、新綠原酸； 2、綠原酸；3、隱綠原酸； 4、咖

14、啡酸；5、3，4’－二咖啡酸?？崴?、3，5’－二咖啡酸?？崴?、4，5’－二咖啡酸?？崴?；8、連翹酯苷D； 9、野黃芩苷,1、野黃芩苷； 2、黃芩苷； 3、千層紙素-7-O-葡萄糖醛酸苷 4、白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷,21,,,,注射液指紋圖譜,,,,,,,,,,,,,,指紋圖譜4,1、天冬氨酸； 2、谷氨酸；3、絲氨酸； 4、甘氨酸；5、蘇氨酸； 6、丙氨酸；7、纈氨酸；

15、 8、苯丙氨酸；9、異亮氨酸； 10、亮氨酸； 11、脯氨酸,熊去氧膽酸,鵝去氧膽酸,,,,可指認(rèn)成分達(dá)到明確結(jié)構(gòu)成分的93％,指紋圖譜3,22,在多指標(biāo)( s，a，b，…) 質(zhì)量評價時，以某一典型有效成分作為內(nèi)參物( s) ，建立內(nèi)參物與其它待測成分( a，b，…） 間的相對校正因子( RCF，fsa，fsb…) 通過相對校正因子達(dá)到測定一個成分( 對照品可得到者)的同時 , 可計算出其它待測有效成分的含量,,什么是“一測

16、多評”（QAMS）？,,一測多評技術(shù)在中藥質(zhì)量控制中的應(yīng)用,23,采用“一測多評”的理由：物質(zhì)基礎(chǔ)研究表明：具有7種有機(jī)酸類：金銀花提取物中含綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、新綠原酸、4，5－二咖啡酸?？崴?、3，4－二咖啡酸?？崴?、3，5－二咖啡酸?？崴峁?種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品的缺乏：除咖啡酸和綠原酸具有標(biāo)準(zhǔn)品外，其余標(biāo)準(zhǔn)品缺乏具有綠原酸的母核：除咖啡酸外，其余6種有機(jī)酸結(jié)構(gòu)類似，均具有綠原酸的母核含量范圍相近：含量范圍為0.02～

17、0.07mg/ml,,金銀花提取物中總有機(jī)酸含量的主要方法學(xué)研究（案例2）,,內(nèi)參物的選擇依據(jù)：具有相同母核的有機(jī)酸---綠原酸,24,波長的選擇（金銀花中的有機(jī)酸類最大吸收波長均在325nm ）流動相組成的考察流動相梯度的考察柱溫及流速的考察不同色譜柱的考察不同儀器的考察,方法中明確了色譜柱等可能影響相對保留時間的因素方法允許流動相比例可以調(diào)節(jié)，并保證分離效果，以適應(yīng)中藥材批次間的合理差異,HPLC 分析方法的研究,25,

18、,金銀花提取物高效液相色譜圖,新綠原酸,綠原酸,隱綠原酸,咖啡酸,3，4’－二咖啡酸?？崴?3，5’－二咖啡酸?？崴?4.5’－二咖啡酸酰奎尼酸,金銀花提取物色譜峰指認(rèn),金銀花提取物中有機(jī)酸類成分占28％-39％,26,,相對校正因子的確定,相對校正因子的確定需要大量，全面的數(shù)據(jù)考察不同濃度范圍不同來源或批號的標(biāo)準(zhǔn)品考察不同儀器的考察,以17個相對校正因子的平均值作為各有機(jī)酸成分的相對校正因子,27,,,1、新綠原酸 2、連

19、翹酯苷D3、綠原酸 4、隱綠原酸 5、咖啡酸6、野黃芩苷7、3，4－二咖啡酸?？崴?8、3，5－二咖啡酸?？崴?9、4，5－二咖啡酸?？崴?避免不同批次樣品中除目標(biāo)色譜峰外雜質(zhì)峰的影響避免目標(biāo)色譜峰的相對保留時間漂出標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的范圍（±5）采用指紋圖譜指認(rèn)峰的方法實現(xiàn)目標(biāo)峰的確認(rèn)（峰1、3、4、5、7、8、9）,考察不同色譜柱，不同儀器的影響結(jié)合DAD光譜、指紋圖譜（特征

20、圖譜）等多種方式對待測目標(biāo)色譜峰以相對保留時間進(jìn)行指認(rèn),待測目標(biāo)色譜峰的定位（保證QAMS法應(yīng)用的前提）,28,一測多評計算結(jié)果與實測結(jié)果表（單位：mg/ml）,采用一測多評測得的結(jié)果與實際測得結(jié)果基本一致，表明建立的方法：相對校正因子準(zhǔn)確，方法可行。,,,準(zhǔn)確度、精密度、專屬性、定量限、檢測限、線性范圍、耐用性等，外標(biāo)法和一測多評法結(jié)果的比較。,其他方法學(xué)考察,29,研究背景 處方中的大黃含有大黃素、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素甲醚，

21、大黃酸等蒽醌類物質(zhì)，化學(xué)結(jié)構(gòu)相似擬采用一測多評的方法進(jìn)行蒽醌類物質(zhì)的含量測定,,制劑中蒽醌類物質(zhì)的含量測定（案例3）,遇到的問題：不同分析儀器會造成相對保留時間的差異缺乏合理的內(nèi)參物同時指認(rèn)目標(biāo)色譜峰以大黃素為內(nèi)參物，采用不同儀器所得蘆薈大黃素和大黃酸的相對保留時間偏差較大（大于15％）,,30,解決方案：分別選擇合理的內(nèi)參物蘆薈大黃素以大黃酸為內(nèi)參物大黃酚、大黃酸和大黃素甲醚以大黃素為內(nèi)參物,,相對保留時間,供試品色譜圖,

22、,相關(guān)系數(shù)達(dá)到了預(yù)期的效果,,,,31,,丹參藥材供試品溶液色譜圖,“丹參”中丹參酮類物質(zhì)的含量測定（案例4）,研究背景 ：收入美國藥典的復(fù)核丹參中含有丹參酮IIA、隱丹參酮、丹參酮I等化合物，結(jié)構(gòu)類似，符合一測多評的要求以丹參酮IIA作為內(nèi)參物，測定隱丹參酮、丹參酮I的含量,,,丹參酮類相同母核,32,復(fù)核中發(fā)現(xiàn)檢測波長的帶寬也會影響相對校正因子，提醒實驗室在進(jìn)行相對校正因子的考察時應(yīng)予以考慮波長的帶寬！,,,發(fā)現(xiàn)的問題： 不同

23、品牌色譜柱會引起相對保留時間的改變，甚至出現(xiàn)出峰順序顛倒解決方案：質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中明確色譜柱類型,,,33,適用于結(jié)構(gòu)類似的同系物同系物紫外光譜圖相似度高，在相同波長處的吸收度相差小，即校正因子相差小同系物相對校正因子不會因為流動相的比例微調(diào)而發(fā)生變化目標(biāo)色譜峰定位是關(guān)鍵全面的考察各種可能影響色譜峰相對保留時間的因素，不同品種可能的影響因素有差異，應(yīng)在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中分別予以明確規(guī)定需以相對保留時間結(jié)合DAD光譜、指紋圖譜（特征圖譜

24、）等多種方式對待測目標(biāo)色譜峰進(jìn)行指認(rèn)相對校正因子的確定需要大量的考察全面的數(shù)據(jù)考察基于工藝穩(wěn)定的產(chǎn)品，避免由于不同批次的不穩(wěn)定帶來的系數(shù)變化,,,“一測多評”技術(shù)應(yīng)用中應(yīng)注意的問題,,,,34,制劑中由于有其他藥味的干擾，可能會影響目標(biāo)色譜峰的分離調(diào)整分離效果時，會出現(xiàn)目標(biāo)色譜峰相對保留時間發(fā)生偏差的現(xiàn)象相鄰色譜峰在定位時會引起混淆,,建議解決方案：配合指紋圖譜或者特征圖譜進(jìn)行色譜峰確認(rèn)，避免有關(guān)問題。,制劑中應(yīng)用一測多評技