LIMK2在流體剪切力介導(dǎo)的成骨細(xì)胞細(xì)胞骨架改建中的作用研究.pdf

1、頜面部骨缺損是口腔領(lǐng)域的常見(jiàn)病，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。但是目前骨缺損的治療方法均存在著早期骨機(jī)械性能不足的缺點(diǎn)，新生的骨組織都需要經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的改建才能在機(jī)械性能上達(dá)到正常行使功能的要求。 既往的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)?shù)膽?yīng)力刺激可以促進(jìn)骨組織的生長(zhǎng)，加速骨缺損的愈合。在微觀領(lǐng)域，同樣存在這種現(xiàn)象：成骨細(xì)胞在受到流體剪切力作用后，其增殖周期發(fā)生變化、堿性磷酸酶水平升高、成骨活性增強(qiáng)。 已有的研究表明，細(xì)胞骨架在細(xì)胞感受應(yīng)力的

2、過(guò)程中起了重要的作用。而當(dāng)細(xì)胞受到應(yīng)力刺激后，其細(xì)胞骨架又會(huì)發(fā)生相應(yīng)的改建，這有可能影響了力一化學(xué)信號(hào)的轉(zhuǎn)換過(guò)程，并導(dǎo)致細(xì)胞的生物力學(xué)特性發(fā)生改變。因此，要深入地研究骨組織的生物力學(xué)特性，進(jìn)一步發(fā)揮應(yīng)力對(duì)骨生長(zhǎng)的促進(jìn)作用，就必須了解應(yīng)力介導(dǎo)下細(xì)胞骨架改建的機(jī)制。但是目前為止，這一機(jī)制還不明了。 本研究以LIMK2(LIM-Kinase)為靶基因，采用RNA干擾的方法沉默LIMK2基因，從而研究LIMK2在流體剪切力介導(dǎo)的細(xì)胞骨架

3、的改建中的作用。本研究分為3個(gè)部分： 實(shí)驗(yàn)一 siRNA及pcDNA3.0-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠原代成骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率比較RNA干擾是生物進(jìn)化過(guò)程中抵抗病毒和轉(zhuǎn)座子的一種防御反應(yīng)，是一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默。目前，RNA干擾技術(shù)已經(jīng)在基因功能研究領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。在RNA干擾的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，較關(guān)鍵的步驟就是如何制備siRNA并將之高效地導(dǎo)入靶細(xì)胞中。目前，較為常用的手段有兩種，分為體外制備法和體內(nèi)表達(dá)法。前者是在體外合成RNA，再導(dǎo)

4、入細(xì)胞內(nèi)；后者則使用能在體內(nèi)表達(dá)RNA的載體作為媒介，將載體導(dǎo)入細(xì)胞后，在細(xì)胞內(nèi)合成RNA。這兩種方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)。體外合成的RNA轉(zhuǎn)染效率較高，但是作用時(shí)間較短，僅僅是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，而且價(jià)格較為昂貴；而后一種方法需要轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒片段大，轉(zhuǎn)染較為困難。 本實(shí)驗(yàn)擬使用脂質(zhì)體Lipofectamine<'TM>M2000分別介導(dǎo)含有FAM標(biāo)記的siRNA和攜帶EGFP基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的小鼠成骨細(xì)胞，并通過(guò)不同實(shí)驗(yàn)條件的組合，篩選其中

5、最理想的轉(zhuǎn)染條件。 方法：分別使用化學(xué)合成的siRNA和可以表達(dá)EGFP的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠原代成骨細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察帶有熒光標(biāo)記的細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的量。再通過(guò)MTT法，檢測(cè)不同的實(shí)驗(yàn)條件下轉(zhuǎn)染后成骨細(xì)胞的存活率。結(jié)果：使用化學(xué)合成的siRNA轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的小鼠成骨細(xì)胞獲得了較高的轉(zhuǎn)染效率，其最大值達(dá)到90﹪以上，與質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率相比有很大的提高，且其細(xì)胞毒性在可接受的范圍內(nèi)。結(jié)論：使用化學(xué)合成的siRNA轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的小鼠成骨細(xì)

6、胞可以獲得較高的轉(zhuǎn)染效率，是一種理想的實(shí)驗(yàn)方法。 實(shí)驗(yàn)二小鼠原代成骨細(xì)胞的LIMK2基因的RNA干擾LIMK是cofilin(絲切蛋白)的調(diào)控分子，它可以磷酸化cofilin的絲氨酸-3殘基使cofilin失活從而抑制后者對(duì)F-actin(聚合態(tài)肌動(dòng)蛋白)的剪切作用。研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)LIMK2可以促進(jìn)細(xì)胞張力纖維的形成；抑制LIMK2的表達(dá)則可以阻斷TGF-β1誘導(dǎo)的纖維母細(xì)胞的細(xì)胞骨架改建。這表明了LIMK2在調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的細(xì)

7、胞骨架改建中起重要的作用。但它是否參與了流體剪切力介導(dǎo)的成骨細(xì)胞的細(xì)胞骨架改建，還有待進(jìn)一步研究。 本實(shí)驗(yàn)擬采用RNA干擾抑制原代成骨細(xì)胞中LIMK2的表達(dá)并檢測(cè)其抑制效率，為進(jìn)一步研究LIMK2在細(xì)胞骨架改建中的作用奠定基礎(chǔ)。 方法：用脂質(zhì)體介導(dǎo)化學(xué)合成的siRNA轉(zhuǎn)染到原代成骨細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后24h和48h提取細(xì)胞的總RNA和總蛋白，分別進(jìn)行RT-PCR和Western-blot檢測(cè)，從三條siRNA中篩選出抑制效率最

8、高的一條。結(jié)果：化學(xué)合成的siRNA對(duì)小鼠原代成骨細(xì)胞的抑制效率最高達(dá)到了70﹪以上。結(jié)論：編號(hào)為R3的siRNA可以很好地抑制小鼠原代成骨細(xì)胞的LIMK2表達(dá)。實(shí)驗(yàn)三抑制LIMK2表達(dá)對(duì)流體剪切力介導(dǎo)的成骨細(xì)胞的細(xì)胞骨架改建的影響通過(guò)前面的研究，已經(jīng)證明了siRNA可以特異性地抑制小鼠原代成骨細(xì)胞中LIMK2的表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，為了了解LIMK2在流體剪切力介導(dǎo)的成骨細(xì)胞的細(xì)胞骨架改建中的作用，本實(shí)驗(yàn)擬使用能特異性抑制LIMK2表達(dá)的

9、siRNA以及不具有抑制效果的陰性對(duì)照RNA分別轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞，并將細(xì)胞置于流體剪切力下加載，觀察加載后細(xì)胞骨架的改變。 方法：將同一批細(xì)胞分為陰性對(duì)照組(加載)、RNA干擾組(加載)、陰性對(duì)照組(不予加載)和RNA干擾組(不予加載)共4組，分別編號(hào)為1、2、3、4。使用陰性對(duì)照siRNA(無(wú)特異性抑制效果)轉(zhuǎn)染1組和3組的成骨細(xì)胞；使用能特異性抑制LIMK2表達(dá)的siRNA轉(zhuǎn)染2組和4組的成骨細(xì)胞。轉(zhuǎn)染完成后使用流體剪切力加載1