流體剪切力影響人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的機(jī)制研究.pdf

1、人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human mesenchymal stem cells，hMSCs)是存在于骨髓基質(zhì)系統(tǒng)中的一種組織干細(xì)胞。由于其具有多向分化潛能和低免疫原性而被作為種子細(xì)胞廣泛應(yīng)用于組織工程，特別是骨組織工程。多種誘因可以誘導(dǎo)hMSCs向成骨細(xì)胞分化，如激素、機(jī)械力學(xué)刺激、細(xì)胞因子等。體內(nèi)骨組織中的組織間隙液能對(duì)骨生成細(xì)胞產(chǎn)生流體剪切力(fluid shear stress，F(xiàn)SS)，這種流體剪切力能促進(jìn)骨生成細(xì)胞的增殖和分化，

2、對(duì)于骨骼的生長(zhǎng)發(fā)育和正常形態(tài)功能的維持非常重要。因此，人們?cè)谶M(jìn)行組織工程骨的研究過(guò)程中，利用生物反應(yīng)器模擬體內(nèi)環(huán)境產(chǎn)生FSS作用于體外培養(yǎng)的hMSCs，以此促進(jìn)組織工程骨的生成。盡管已有研究證明FSS能促進(jìn)hMSCs向成骨細(xì)胞分化。但是關(guān)于FSS促進(jìn)hMSCc成骨分化的機(jī)理目前還尚不完全清楚。
　　 在本項(xiàng)研究中我們利用灌流培養(yǎng)體系產(chǎn)生FSS作用于接種在多孔隙PLGA-3D支架上的hMSCs，研究FSS對(duì)hMSCs分化的影響及相

3、關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。主要包括以下三個(gè)部分：第一部分：檢測(cè)了4.2 dynes/cm2間歇性FSS、4.2dynes/cm2持續(xù)性FSS和0.34dynes/cm2的FSS三種不同的FSS對(duì)hMSCs成骨分化的影響，并且檢驗(yàn)了ERK1/2在FSS促進(jìn)hMSCs成骨分化的過(guò)程中的作用以及三種不同F(xiàn)SS對(duì)ERK1/2活性的影響。利用RT-PCR檢測(cè)不同培養(yǎng)條件下hMSCs內(nèi)ALP、COLIα、OCN和Runx2等與成骨分化相關(guān)的特異基因的表達(dá)情況

4、，采用改良鈣鈷染色和ALP活性檢測(cè)試劑盒分別進(jìn)行定性和定量分析不同F(xiàn)SS對(duì)hMSCs的ALP活性的影響。采用Western-blot檢測(cè)ERK1/2的磷酸化水平。并且檢測(cè)在用PD98059抑制ERK1/2活性的基礎(chǔ)上，F(xiàn)SS對(duì)各成骨分化特異性基因的表達(dá)和ALP活性的影響。結(jié)果表明4.2 dynes/cm2間歇性FSS能有效地促進(jìn)hMSCs向成骨細(xì)胞分化，而4.2 dynes/cm2持續(xù)性FSS和0.34dynes/cm2的FSS對(duì)hMS

5、Cs沒(méi)有明顯的誘導(dǎo)分化作用，并且4.2 dynes/cm2間歇性FSS較其他兩種FSS能更有效地提高ERK1/2的活性。同時(shí)我們的實(shí)驗(yàn)還證明了ERK1/2在FSS促進(jìn)hMSCs成骨分化的過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。
　　 第二部分：主要驗(yàn)證了β1整合素是否在FSS促進(jìn)hMSCS成骨分化的過(guò)程中充當(dāng)力學(xué)受體感受力學(xué)刺激以及FSS所引起的ERK1/2活化是否通過(guò)提高Runx2轉(zhuǎn)錄活性而調(diào)節(jié)與成骨分化相關(guān)基因的表達(dá)。采用western-

6、blot檢測(cè)在FSS作用下，hMSCs內(nèi)ERK1/2、β1整合素和FAK等的活化情況或蛋白水平，利用免疫共沉淀檢測(cè)了FSS對(duì)Runx2的酪氨酸磷酸化水平的影響，并且檢測(cè)了在用小分子多肽RGDS特異性阻斷β1整合素和胞外基質(zhì)之間的連接后，F(xiàn)SS對(duì)FAK和ERK1/2的活性的影響。最后檢測(cè)在用PD98059抑制ERK1/2活性后，F(xiàn)SS對(duì)Runx2的磷酸化水平和β1整合素的表達(dá)的影響。結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)在FSS的作用下細(xì)胞內(nèi)的ERK1/2、FAK

7、和Runx2磷酸化水平顯著升高，β1整合素的表達(dá)水平也顯著升高。而用小分子多肽RGDS特異性阻斷β1整合素后，F(xiàn)SS未能引起的ERK1/2和FAK的磷酸化水平升高。并且經(jīng)PD98059處理后，F(xiàn)SS亦未能提高Runx2的活性和上調(diào)β1整合素的表達(dá)。以上結(jié)果表明在FSS促進(jìn)hMSCs成骨分化的過(guò)程中，F(xiàn)SS所引起的ERK1/2和FAK活化依賴β1整合素感受力學(xué)刺激，活化的ERK1/2不僅能通過(guò)提高Runx2的轉(zhuǎn)錄活性而啟動(dòng)與成骨分化相關(guān)的

8、基因表達(dá)，還能反饋調(diào)節(jié)β1整合素的表達(dá)。
　　 第三部分：在第一、二部分研究中，我們發(fā)現(xiàn)ERK1/2對(duì)因FSS引起的Runx2和β1整合素表達(dá)升高具有重要的調(diào)節(jié)作用，但是ERK1/2是通過(guò)那些信號(hào)途徑來(lái)調(diào)節(jié)其表達(dá)的呢？目前還尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。由于BMPs/Smad1/5/8信號(hào)通路是調(diào)節(jié)Runx2表達(dá)的重要信號(hào)通路，而NFKB已被證明是調(diào)節(jié)BMP2、BMP4和β1整合素表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子。我們猜測(cè)FSS引起的ERK1/2活化可能通過(guò)

9、提高NFκB轉(zhuǎn)錄活性而上調(diào)節(jié)β1整合素和BMP2、BMP4表達(dá)，再通過(guò)活化BMPs/Smad1/5/8信號(hào)通路而調(diào)節(jié)Runx2的表達(dá)。為了驗(yàn)證以上猜測(cè)，我們分別采用RT-PCR和Western-blot檢測(cè)了FSS對(duì)hMSCs內(nèi)的BMP2和BMP4表達(dá)以及對(duì)Smad1/5/8活性的影響，并且在用人重組noggin蛋白阻斷BMPs/Smad1/5/8信號(hào)通路后檢測(cè)FSS對(duì)Runx2表達(dá)和Smad1/5/8活性的影響。其次用Western-

10、blot和免疫熒光染色分別檢測(cè)了FSS對(duì)NFKB活性和核轉(zhuǎn)移的影響，并且檢測(cè)在用BAY11-7082抑制NFκB核轉(zhuǎn)移后，F(xiàn)SS對(duì)BMP2、BMP4、Runx2和β1整合素表達(dá)的影響以及對(duì)Smad1/5/8活性的影響。最后采用PD98059抑制ERK1/2活性后檢測(cè)FSS對(duì)NFκB和Smad1/5/8活性的影響以及對(duì)BMP2和BMP4表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)FSS能使hMSCs內(nèi)的BMP2和BMP4的mRNA水平和Smad1/5/8活性顯著

11、升高，經(jīng)noggin處理后，F(xiàn)SS未能使hMSCs內(nèi)的Runx2表達(dá)水平和Smad1/5/8的升高。此外，F(xiàn)SS能使p65 NFκB的活性和核轉(zhuǎn)移率顯著升高，而抑制NFκB核轉(zhuǎn)移后，F(xiàn)SS所引起的β1整合素、Runx2、BMP2和BMP4表達(dá)以及Smad1/5/8的磷酸化也受到抑制。PD98059不僅能抑制FSS所導(dǎo)致的p65NFKB活化和核轉(zhuǎn)移還能抑制FSS所引起的BMP2和BMP4的表達(dá)以及Smad1/5/8活化。以上結(jié)果表明在FS

12、S影響hMSCs成骨分化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制中，ERK1/2能通過(guò)調(diào)節(jié)NFκB的轉(zhuǎn)錄活性而影響β1整合素和BMPs的表達(dá)，BMPs進(jìn)而影響Smad1/5/8的活化，調(diào)節(jié)Runx2的表達(dá)，ERK1/2在該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制中起著非常關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。
　　 本項(xiàng)研究不僅驗(yàn)證了間歇性FSS較持續(xù)性FSS能有效地促進(jìn)hMSCs向成骨細(xì)胞分化，而且證明了在FSS促進(jìn)hMSCs成骨分化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制中，β1整合素感受FSS所產(chǎn)生的力學(xué)刺激進(jìn)而引起ERK