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文檔簡介
1、骨改建的過程中機(jī)械應(yīng)力起著重要的作用。在骨組織細(xì)胞感受的諸多力學(xué)信號中,流體剪切力是最主要的一種形式。在骨改建過程中,成骨細(xì)胞起著重要的作用。研究表明,流體剪切力刺激后,成骨細(xì)胞的肌動蛋白細(xì)胞骨架會發(fā)生改建。 肌動蛋白細(xì)胞骨架是一種位于細(xì)胞核及胞漿內(nèi)的纖維狀蛋白質(zhì)基質(zhì),是細(xì)胞內(nèi)傳遞應(yīng)力信號的重要途徑。應(yīng)力刺激可以引起肌動蛋白細(xì)胞骨架組成的張力絲的再分布,從而引起肌動蛋白細(xì)胞骨架的改建和細(xì)胞形態(tài)的改變。但是剪切力刺激成骨細(xì)胞后,肌
2、動蛋白細(xì)胞骨架改建的微觀機(jī)制目前尚不明了。 研究表明,cofilin(絲切蛋白)是存在于真核細(xì)胞胞漿內(nèi)的一種可以解聚肌動蛋白纖維的蛋白。在肌動蛋白細(xì)胞骨架的動態(tài)改建過程中,cofilin起著重要的作用。體外研究表明,多種刺激可以通過cofilin的磷酸化變化,從而調(diào)控成骨細(xì)胞的肌動蛋白細(xì)胞骨架改建。另有研究表明,cofilin介導(dǎo)了流體剪切力刺激引起平滑肌細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞的肌動蛋白細(xì)胞骨架改建。而對于成骨細(xì)胞,cofilin是
3、否同樣介導(dǎo)了剪切力刺激引起的肌動蛋白細(xì)胞骨架改建,目前尚沒有文獻(xiàn)報道。 本實(shí)驗(yàn)對成骨細(xì)胞施加流體剪切力作用,觀察肌動蛋白細(xì)胞骨架的改建,并通過Western blot技術(shù)檢測cofilin的磷酸化水平變化,進(jìn)一步了解剪切力刺激引起的成骨細(xì)胞肌動蛋白細(xì)胞骨架改建的微觀機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)分為兩部分: 實(shí)驗(yàn)一:不同時間剪切力作用對成骨細(xì)胞肌動蛋白細(xì)胞骨架改建的影響 目的:研究成骨細(xì)胞受到不同時間流體剪切力作用后,肌動蛋白細(xì)胞
4、骨架的改建變化,為下一步研究肌動蛋白細(xì)胞骨架改建的微觀機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法:原代培養(yǎng)小鼠成骨細(xì)胞,堿性磷酸酶以及Von Kossa礦化結(jié)節(jié)染色對成骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定;選用μ-slide作為剪切力加載裝置,采用12 dyne/cm<'2>流體剪切力對成骨細(xì)胞作用不同時間后,用FITC-phalloidin對各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的F-actin染色,激光共聚焦顯微鏡下觀察各實(shí)驗(yàn)組肌動蛋白細(xì)胞骨架的改建變化。 結(jié)果:酶消化法與組織塊法
5、體外培養(yǎng)獲取了原代成骨細(xì)胞,堿性磷酸酶以及VonKossa礦化結(jié)節(jié)染色陽性;剪切力作用后各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的F-actin明顯較對照組增粗,隨時間延長,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的F-actin的染色逐漸增強(qiáng)、纖維增粗;45 min后隨剪切力作用時間的延長,肌動蛋白細(xì)胞骨架的改建趨于緩慢。 結(jié)論:采用兩種酶分段消化法,獲得了活力較旺盛、純度較高的成骨細(xì)胞;12dyne/cm2剪切力作用下,15 min便可以使成骨細(xì)胞的肌動蛋白細(xì)胞骨架發(fā)生改建。45
6、min后隨剪切力作用時間的延長,肌動蛋白細(xì)胞骨架的改建趨于緩慢。 實(shí)驗(yàn)二:cofilin在介導(dǎo)剪切力引起成骨細(xì)胞肌動蛋白細(xì)胞骨架改建中的作用研究 目的:研究cofilin在流體剪切力引起的肌動蛋白細(xì)胞骨架改建中的作用。 方法:設(shè)計制作平行平板流室加載裝置,在此基礎(chǔ)上,采用12 dyne/cm<'2>的剪切力作用成骨細(xì)胞后,Western blot技術(shù)測定細(xì)胞內(nèi)cofilin以及磷酸化eofilin(phospho
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