EGFR抑制劑及聯(lián)合放化療對(duì)頭頸鱗癌體外治療和療效預(yù)測(cè).pdf

1、目的： 頭頸癌被認(rèn)為是第七大常見(jiàn)腫瘤，其中鱗狀細(xì)胞癌(Squamous cell carcinoma of the head and neck，HNSCC)占頭頸癌的90％。手術(shù)、放療或手術(shù)聯(lián)合放療是頭頸癌治療的基礎(chǔ)。近年來(lái)，隨著放化療聯(lián)合治療模式的逐步建立，晚期病人生存率和局部控制率有了一定程度的提高。然而在頭頸癌放化療治療中仍然存在一些問(wèn)題，如：放化療毒副作用大、腫瘤對(duì)放化療不敏感、治療后病人復(fù)發(fā)率高、5年生存率低等。迄今為

2、止，頭頸癌放化治療和療效預(yù)測(cè)仍是腫瘤治療的一個(gè)難題。 腫瘤特異性分子的靶向治療具有特異性強(qiáng)、在有效殺滅腫瘤細(xì)胞的同時(shí)不損傷正常組織的優(yōu)點(diǎn)，它是針對(duì)可能導(dǎo)致細(xì)胞癌變的環(huán)節(jié)，從分子水平逆轉(zhuǎn)這種惡性生物學(xué)行為，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的生物治療模式。其中表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal growth factor receptor，EGFR)是當(dāng)前分子靶向治療研究的熱點(diǎn)。EGFR是ErbB酪氨酸激酶受體。該家族共有4個(gè)成員即EGFR/

3、ErbB1，HER2/ErbB2，HER3/ErbB3及HER4/ErbB4。ErbB與特異的配體結(jié)合形成配體—受體二聚體，隨后發(fā)生自身磷酸化，激活其下游主要信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，如細(xì)胞增殖、凋亡、血管形成、細(xì)胞粘附等，可導(dǎo)致細(xì)胞癌變，進(jìn)而發(fā)生浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移等。研究表明，80％—90％頭頸鱗癌患者的EGFR為陽(yáng)性。EGFR的過(guò)度表達(dá)與預(yù)后差、轉(zhuǎn)移快、生存期短和放化療不敏感等密切相關(guān)。 EGFR的靶向藥物主要有兩類：一類為單克隆抗

4、體，如西妥昔單抗(Cetuximab，Erbitux，IMC—C225)，它是特異性阻斷EGFR的IgG1單克隆抗體，針對(duì)受體胞外配體連接區(qū)，阻止配體與受體的結(jié)合而抑制受體的激活。另一類為小分子酪氨酸激酶抑制劑，如易瑞沙(Gefitinib，Iressa，ZD1839)，主要抑制受體胞內(nèi)酪氨酸激酶活性區(qū)。 EGFR靶向藥物只起到抑制腫瘤的作用，不能殺傷腫瘤細(xì)胞，其有效率在10％左右。因此，靶向治療聯(lián)合放化療可能有利于提高療效，

5、減少副作用，是腫瘤治療的發(fā)展趨勢(shì)。 目前，在晚期頭頸鱗癌治療中，有學(xué)者報(bào)道Cetuximab聯(lián)合放療或化療提高了療效。但Gefitinib聯(lián)合放療是否也有相似的療效；Cetuximab聯(lián)合化療(Cisplatin)及常規(guī)放療是否能提高療效；以及對(duì)它們療效的預(yù)測(cè)，國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用10株頭頸鱗癌細(xì)胞克隆模型，分別比較單藥治療、聯(lián)合治療對(duì)細(xì)胞生存活性的影響，同時(shí)檢測(cè)了10株HNSCC細(xì)胞的ErbB家族成員蛋白表達(dá)及信號(hào)通路關(guān)

6、鍵因子，預(yù)測(cè)EGFR抑制劑在頭頸鱗癌治療中的療效，為進(jìn)一步提高頭頸鱗癌治療療效，合理應(yīng)用靶向治療提供重要線索。 方法： 一、研究對(duì)象 新建的10株人頭頸鱗癌細(xì)胞系，標(biāo)記為UT—SCC(本文簡(jiǎn)寫為SCC)。SCC—8，SCC—9，SCC—11，SCC—19a，SCC—29，SCC—34和SCC—38來(lái)源于喉癌(其中SCC—9源于頸轉(zhuǎn)移，SCC—11源于復(fù)發(fā)病例)，SCC—24a1，SCC—24a2和SCC—40來(lái)源

7、于舌癌。 二、研究方法 1、細(xì)胞培養(yǎng)： 細(xì)胞系傳代于15—30代之間。10％熱滅活胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS) DMEM培養(yǎng)基貼壁生長(zhǎng)，孵育箱培養(yǎng)，0.01％胰蛋白酶(trypsin)及0.02％K—EDTA消化傳代，每周傳代1—2次，細(xì)胞維持在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)。 2、克隆形成率分析法： Ham’s F—12(15％ FBS)培養(yǎng)液。96孔培養(yǎng)板每孔細(xì)胞的接種數(shù)根據(jù)細(xì)胞植

8、盤率(Plating efficiency，PE)調(diào)整。加干預(yù)因素，孵育箱培養(yǎng)4周，倒置顯微鏡下觀查，每孔活細(xì)胞≥32個(gè)的孔作為陽(yáng)性孔而計(jì)數(shù)。 3、Western blot方法： 檢測(cè)人HNSCC細(xì)胞ErbB家族成員蛋白表達(dá)和活性。細(xì)胞裂解液以相同蛋白量上樣，SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳，分別進(jìn)行一抗、二抗雜交，ECL顯色。 4、RT—qPCR方法： 檢測(cè)人HNSCC細(xì)胞ErbB家族成員mRNA表達(dá)。

9、 (1) Primer Express software設(shè)計(jì)引物和Taqman探針。 (2)利用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA。 (3)重組質(zhì)粒pEBS7—EGFR作為標(biāo)準(zhǔn)品，actin為對(duì)照。 三、實(shí)驗(yàn)分組 1、96孔培養(yǎng)板克隆形成率分析法檢測(cè)HNSCC細(xì)胞對(duì)三種藥物(Cetuximab，Gefitinib，Cisplatin)的敏感性(IC70和IC50)。 實(shí)驗(yàn)設(shè)細(xì)胞對(duì)照組和藥物(5種不

10、同濃度)處理組。 2、96孔培養(yǎng)板克隆形成率分析法檢測(cè)HNSCC細(xì)胞對(duì)Cetuximab或Gefitinib聯(lián)合放療療效。 Cetuximab/Gefitinib+Radiation： (1)單純放射組：分0 Gy，0.75 Gy，1.25 Gy，2.5 Gy，5.0 Gy和7.5 Gy單次照射。 (2)放射+藥物組：放射劑量同上。Cetuximab或Gefitinib IC70。 (3)放射+

11、藥物組：放射劑量同上。Cetuximab或Gefitinib IC50。 3、96孔培養(yǎng)板克隆形成計(jì)數(shù)法檢測(cè)HNSCC細(xì)胞對(duì)Cetuximab聯(lián)合順鉑(Cisplatin)及放療療效。 Cetuximab+Cisplatin+Radiation： (1)單純放射組：分0 Gy，0.75 Gy，1.25 Gy，2.5 Gy，5.0 Gy和7.5 Gy單次照射。 (2)放射+化療組：放射劑量同上。Cispl

12、atin IC70。 (3)放射+化療+藥物組：化放療方法同(2)，Cisplatin IC70，Cetuximab IC70。 (4)放射+化療+藥物組：化放療方法同(2)，Cisplatin IC70，Cetuximab IC50。 四、療效評(píng)價(jià)與統(tǒng)計(jì)分析 1、細(xì)胞植盤率(PE)： PE=—In(陰性孔數(shù)量/全部孔數(shù)量)/每孔使用細(xì)胞數(shù)量。 2、藥物敏感性： Cetuxim

13、ab，Gefitinib，Cisplatin的敏感性用IC50，IC70表示，即抑制50％，30％克隆形成所需的濃度。 3、聯(lián)合治療療效評(píng)價(jià)： (1)細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)(Survival fraction，SF)=(陽(yáng)性孔數(shù)量/每孔使用細(xì)胞數(shù)量)×控制組每孔使用細(xì)胞數(shù)量/控制組中陽(yáng)性孔數(shù)量。適用于線性二次(LQ)模型F=exp[—(αD+βD2)]，擬合劑量生存曲線，(D表示劑量，α和β為劑量效應(yīng)系數(shù)，α：為單擊所產(chǎn)生的細(xì)胞死

14、亡，即細(xì)胞存活曲線的初斜率；β：由于損傷累積而導(dǎo)致細(xì)胞死亡)。 (2)通過(guò)數(shù)值整合獲得曲線下面積(Area under the curve，AUC)值等同于平均致死(失活)劑量，AUC=1/α+(1.0)(DF—1)。聯(lián)合放療AUC率=(藥物+放療)AUC/放療AUC；聯(lián)合放化療AUC率=(藥物+放療+化療)AUC/放療AUC。 (3)聯(lián)合治療療效評(píng)價(jià)采用細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)(SF)和AUC率的比較分析，比較分析采用t檢驗(yàn)。藥物

15、劑量對(duì)超相加作用的影響采用單因素方差分析(ANOVA)。Cetuximab或Gefitinib聯(lián)合放療療效和Cetuximab聯(lián)合化療(Cisplatin)及放療的療效評(píng)價(jià)采用“相加效應(yīng)”(P>0.05)即藥物+放療(或放化療)的附加效應(yīng)；“超相加效應(yīng)”(P<0.05)即大于藥物+放療(或放化療)的附加效應(yīng)亦即協(xié)同效應(yīng)。 4、相關(guān)性分析： ErbB表達(dá)與Cetuximab或Gefitinib藥物敏感性(IC50)及放療

16、敏感性(AUC)的相關(guān)性采用Spearman統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05為有相關(guān)性。 結(jié)論： 1、HNSCC體外研究表明，Cetuximab或Gefitinib聯(lián)合放療的療效優(yōu)于單獨(dú)放療(相加效應(yīng))，Gefitinib(5株超相加效應(yīng))對(duì)HNSCC細(xì)胞的療效優(yōu)于Cetuximab(1株超相加效應(yīng))。在Cetuximab聯(lián)合放療中，Cetuximab IC50劑量組作用最敏感的兩株細(xì)胞與Cetuximab單藥治療中最敏感的兩株細(xì)

17、胞相一致。在Cetuximab聯(lián)合Cisplain及放療中，使用Cetuximab(IC70/IC50)和低劑量Cisplatin(IC70)可以提高療效(相加效應(yīng))，優(yōu)于單純放療或放化療，并且超相加作用的兩株細(xì)胞與Cetuximab單藥治療中最敏感的兩株細(xì)胞相一致。結(jié)果提示Cetuximab的敏感性可以預(yù)測(cè)Cetuximab聯(lián)合放療或聯(lián)合放化療的療效。 2、pErbB2和ErbB3表達(dá)水平與HNSCC細(xì)胞對(duì)Gefitinib抵