小鼠心肌肥厚、心衰發(fā)展過程中電生理重構(gòu)及其機制研究.pdf

1、心肌肥厚、心衰是高血壓、缺血性心肌病、心瓣膜病等許多心血管疾病的常見合并癥，心肌肥厚、心衰常常伴發(fā)心律失常，特別是心衰期心源性猝死(SCD)的發(fā)生率大大增加。近年來，盡管在心衰的藥物治療上已取得很大的進展，但心衰病人的死亡率仍然較高。故揭示心肌肥厚、心衰病理過程中心律失常產(chǎn)生的分子機制，尋找有效的防治措施，是心血管領(lǐng)域研究的重要課題。 心肌動作電位時程取決于去極化和復極化電流相互之間精細的平衡，任何內(nèi)向電流的增加或/和外向電流的

2、減少均可使其延長。實驗表明，L-型Ca電流(I<,Ca-L>)的變化依實驗動物的種類和心衰進展的程度報道結(jié)果不一，而瞬時外向鉀電流I<,t0>的下調(diào)則似是較為普遍的現(xiàn)象。已在不同原因所致的多種實驗動物(包括狗、兔、大鼠、貓等)心肌肥厚、心衰模型及心衰的人心室細胞上觀察到I<,t0>的減小。故對I<,t0>。在心肌肥厚、心衰病理狀況下的變化成為目前該領(lǐng)域研究的熱點。然而，小鼠作為目前電生理研究常用的模型動物，心肌肥厚、心衰時對I<,t0>

3、有限的幾篇報道結(jié)果卻極不一致。除I<,t0>外，參與心室復極化的電壓依賴性K<'+>電流尚有I<,K,slow>和I<,ss>，在病理情況下I<,K,slow>和I<,ss>的改變卻報道很少。另外，心肌肥厚、心衰時K<'+>電流改變的細胞內(nèi)信號傳導通路尚不清楚。 本實驗擬在小鼠心肌肥厚、心衰模型上，采用膜片鉗技術(shù)，觀察不同病理發(fā)展階段小鼠心室肌內(nèi)膜下、外膜下心肌細胞動作電位、L-型鈣電流(I<,Ca-L>)、電壓依賴性K<'+>

4、電流I<,t0>、I<,K,slow>及I<,ss>隨時間變化的特點，并通過應(yīng)用calcineurin的特異性抑制劑環(huán)孢素A(CsA)，探討K<'+>電流病理性改變可能的細胞內(nèi)信號傳導通路，為揭示心肌肥厚、心衰的電生理重構(gòu)特征及其機制提供實驗依據(jù)。 第一部分心肌肥厚和心衰不同時期小鼠左心室跨壁動作電位的變化 目的：觀察了小鼠由健康正常狀態(tài)逐漸向心肌肥厚、心衰轉(zhuǎn)變過程中，左室游離壁心內(nèi)膜下、心外膜下細胞動作電位時程及跨壁異

5、質(zhì)性的變化，為揭示心律失常產(chǎn)生的細胞機制提供實驗依據(jù)。 方法：(1)動物模型制備：將小鼠深麻醉后開胸，暴露主動脈弓，部分分離：用外徑0.4mm針頭與主動脈弓平行結(jié)扎，抽出針頭，使主動脈弓狹窄65％-70％。術(shù)后左心室后負荷增加，血液流出受阻，造成壓力超負荷性心肌肥厚和心衰的動物模型；觀察動物的一般狀況并測定心指數(shù)和血流動力學各參數(shù)(LVSP、±dp/dt)。(2)酶解法分離小鼠左室游離壁內(nèi)、外膜下心肌細胞：取下酶解好的心臟，將左

6、室游離壁的心底和心尖部去掉，用眼科剪平行于左室游離壁中間部分分別剪取心內(nèi)膜下心肌(0.5mm左右)和心外膜下心肌(0.5mm左右)，分別放在KB液中輕柔吹打，用200目篩網(wǎng)過濾，獲得的細胞在室溫(23℃～25℃)下靜置2 h后備用。(3)采用打孔式膜片鉗技術(shù)記錄單細胞動作電位，靜息膜電位在-65 mV以上的細胞予以波寬10 ms，1Hz的方波，100％～120％閾電流誘導動作電位，計算出APD，包括動作電位復極達50％的時程(APD<,

7、50>)、動作電位復極達90％的時程(APD<,90>)。在電壓鉗下以鉗制電壓為-40 mV，超級化-20 mV得到的細胞電容電流積分值，計算出細胞電容。 結(jié)論：(1)在心肌肥厚的早期階段(2周) 即出現(xiàn) AP 的延長，肥厚期外膜延長超過內(nèi)膜，使跨壁復極梯度消失。(2)心衰期主要的變化是內(nèi)膜 AP 的延長，造成內(nèi)、外膜下心肌細胞復極離散度增大。即內(nèi)、外膜下細胞生理跨壁復極梯度的消失或增大分別構(gòu)成了肥厚、心衰兩個階段心律失常產(chǎn)生的

8、細胞基礎(chǔ)。 第二部分心肌肥厚和心衰不同時期小鼠左心室跨壁L-型鈣電流的變化 目的：觀察心肌肥厚、心衰時內(nèi)膜下和外膜下心肌細胞L-型鈣電流(L<,Ca-L>)的變化。 方法：利用小鼠壓力超負荷性心肌肥厚、心衰模型，在術(shù)后5周(Band5w，心肌肥厚)和13周(Band 13w，心力衰竭)兩時間點，采用全細胞膜片鉗技術(shù)記錄了左室游離壁內(nèi)膜下細胞(Endo)和外膜下細胞(Epi)的I<,Ca-L>及其動力學改變。

9、 結(jié)論：(1)生理狀態(tài)下小鼠左心室內(nèi)、外膜下細胞I<,Ca-L>密度不存在明顯差別，提示，I<,Ca-L>與APD跨壁異質(zhì)性的產(chǎn)生無關(guān)；(2)心肌肥厚時內(nèi)膜下細胞I<,Ca-L>減少，而外膜下細胞沒有改變，I<,Ca-L>這種非同步的變化可能是此期AP跨壁梯度消失的離子基礎(chǔ)。(3)同樣，心衰時內(nèi)膜下細胞I<,Ca-L>密度明顯減少，而外膜下細胞I<,Ca-L>密度無明顯改變，這種I<,Ca-L>的非同步變化在此期可起到對抗內(nèi)膜APD延

10、長，減少復極離散度的有益作用。即內(nèi)、外膜下細胞I<,Ca-L>非同步性改變，可能在肥厚、心衰兩個不同時期有著不同的作用。 第三部分心肌肥厚、心衰不同時期左心室跨壁電壓依賴性鉀電流的變化 目的：觀察術(shù)后5周、13周(分別代表肥厚、心衰兩個時期)左室游離壁內(nèi)、外膜下細胞電壓依賴性鉀電流I<,to>、I<,K,slow>及I<,ss>的變化及其動力學改變，試圖揭示心肌肥厚、心衰不同時期AP跨壁異質(zhì)性改變的離子基礎(chǔ)。 方

11、法：利用小鼠壓力超負荷性心肌肥厚、心衰模型，采用全細胞膜片鉗技術(shù)，觀察了心肌肥厚(Band 5w)、心衰(Band 13w)小鼠左室游離壁內(nèi)、外膜下心肌細胞電壓依賴性鉀電流I<,t0>、I<,K,slow>及I<,ss>跨壁異質(zhì)性的變化。各種電壓刺激下得到電流的衰減相使用雙指數(shù)擬和區(qū)分出三種電流成分I<,to>、I<,K,slow>、I<,ss>及其失活常數(shù)(τ<,decay>)τ<,1>和τ<,2>，并觀察了病理狀況下通道的動力學特征

12、。 結(jié)論：(1)生理狀態(tài)下小鼠左心室內(nèi)、外膜下細胞I<,t0>密度存在明顯的差別，即外膜高于內(nèi)膜，這可能是AP生理跨壁梯度形成的主要離子基礎(chǔ)。I<,K,slow>和I<,ss>密度不存在內(nèi)、外膜下細胞的差別。(2)心肌肥厚階段即存在顯著的各種電壓依賴性K<'+>電流的下調(diào)，是動作電位延長的離子基礎(chǔ)。I<,t0>、I<,ss>在內(nèi)、外膜下細胞呈同步減少，I<,K,slow>只是在內(nèi)膜下細胞下調(diào)，加上I<,Ca>的非同步下調(diào)構(gòu)成了此

13、期AP跨壁梯度消失的離子基礎(chǔ)。(3)心衰期突出的變化是I<,t0>、I<,K,slow>內(nèi)、外膜下細胞非同步的下降，即內(nèi)膜減少大于外膜，構(gòu)成了AP跨壁異質(zhì)性增大的離子基礎(chǔ)。各種電壓依賴性K<'+>電流顯著的非同步下調(diào)，是心肌肥厚、心衰不同階段AP跨壁異質(zhì)性表現(xiàn)的重要基礎(chǔ)。 第四部分Calcineurin信號通路在失代償性心衰期K<'+>電流下調(diào)中的作用 目的：本實驗通過應(yīng)用calcineurin的特異性抑制劑環(huán)孢素A(C

14、sA)，阻斷calcineurin信號通路，觀察失代償性心衰期小鼠心室肌內(nèi)、外膜下心肌細胞電壓依賴性鉀電流I<,t0>，I<,K,slow>，I<,ss>的改變，意圖評價Ca<'2+><,i>/CaM-calcineurin-NFAT 通路在心衰期跨壁電壓依賴性鉀電流下調(diào)中的作用，為尋找可能的抗心律失常藥提供實驗依據(jù)。 方法：在小鼠壓力超負荷性心肌肥厚、心衰模型上，于術(shù)后9周起皮下注射CsA，25mg/Kg，2次/天，連續(xù)兩周。

15、實驗分為：Band+CsA 組、Band+Veh組，為進一步說明CsA 對正常和病理狀態(tài)下心肌作用的選擇性，Sham 周組中設(shè)與 Band 周同期的治療組和對照組，即Sham+CsA組、Sham+Veh組。測定各組內(nèi)、外膜下心肌細胞心質(zhì)量指數(shù)，并對各組心肌組織進行組織病理學觀察。同時采用全細胞膜片鉗技術(shù)，觀察了小鼠左室游離壁內(nèi)、外膜下心肌細胞膜電容及電壓依賴性鉀電流I<,t0>、I<,K,slow>及I<,ss>跨壁異質(zhì)性的變化。

16、 結(jié)論 1．小鼠左心室內(nèi)、外膜下細胞生理跨壁復極梯度的消失或增大分別構(gòu)成了肥厚、心衰兩個階段心律失常產(chǎn)生的細胞基礎(chǔ)。 2．生理狀態(tài)下小鼠左心室內(nèi)、外膜下細胞I<,Ca-L>與APD跨壁異質(zhì)性的產(chǎn)生無關(guān)；內(nèi)、外膜下細胞I<,Ca-L>非同步性改變，在肥厚、心衰兩個不同時期有著不同的作用：心肌肥厚時I 也非同步的變化可能是此期AP跨壁梯度消失的離子基礎(chǔ)，心衰時I<,Ca-L>的非同步變化在此期可起到對抗內(nèi)膜AP

17、D延長，減少復極離散度的有益作用。 3．小鼠左心室各種電壓依賴性K<'+>電流顯著的非同步下調(diào)，是心肌肥厚、心衰不同階段AP跨壁異質(zhì)性表現(xiàn)的重要基礎(chǔ)。心肌肥厚階段I<,t0>、I<,ss>在內(nèi)、外膜下細胞呈同步減少，I<,K,slow>只是在內(nèi)膜下細胞下調(diào)，加上I<,Ca>的非同步下調(diào)構(gòu)成了此期 AP 跨壁梯度消失的離子基礎(chǔ)；心衰期突出的變化是I<,t0>、I<,K,slow>內(nèi)、外膜下細胞非同步的下降，即內(nèi)膜減少大于外膜，構(gòu)成

18、了AP跨壁異質(zhì)性增大的離子基礎(chǔ)。 4．calcineurin信號通路是I<,K,slow>病理性下調(diào)的主要原因。I<,t0>的下調(diào)除calcineurin 信號通路外還有其他信號調(diào)節(jié)途徑參與。抑制calcineurin信號通路可以對抗心衰病理狀態(tài)下電壓依賴性鉀電流I<,t0>，I<,K,slow>，I<,ss>的重構(gòu)，對內(nèi)膜下細胞的抑制作用明顯高于外膜下細胞，故降低了跨壁復極離散度。提示抑制該信號傳導通路可望成為心衰心律失常和猝