利用誘導性NR1條件基因敲除小鼠研究NMDA受體在空間記憶提取中的作用.pdf

1、大量研究表明，海馬神經元突觸的NMDA受體在空間記憶的信息處理過程中起著重要的分子開關的作用。長期空間記憶與其它類型的長期記憶一樣，可分為獲得、鞏固、儲存及提取四個階段，探討NMDA受體在空間記憶不同階段的功能，不僅有助于理解空間記憶的形成過程和分子機制，還將對闡述記憶的本質等問題有重要啟示作用。 藥理學和遺傳學的證據(jù)都揭示海馬NMDA受體的活性和NMDA受體依賴的突觸可塑性在動物空間記憶的獲得、鞏固和儲存階段起著關鍵作用，在任

2、務學習之前以及任務記憶的鞏固和儲存階段阻斷NMDA受體的作用、或敲除NMDA受體的核心亞基NR1基因，都將妨礙動物空間記憶的形成。但以往的工作對NMDA受體在記憶提取過程中的作用還少有涉及。 本文將Cre／loxP重組系統(tǒng)與四環(huán)素操縱子中的人工轉錄活化因子tTA結合起來，即利用誘導性的條件基因敲除技術（第三代基因敲除技術），構建了在海馬CA1亞區(qū)和前腦區(qū)特異性敲除NR1基因的小鼠，分別稱iCA1-KO小鼠和iFB-KO小鼠。在這

3、兩種小鼠的染色體中，有4個基因位點同時被修飾。通過給小鼠喂食正常食物或含強力霉素（doxycycline，簡稱dox）的食物，可達到在時間上對NR1基因的敲除進行調控，即給小鼠喂食含dox的食物（6mg／g，下同）5天后，可獲得基因敲除的效果；反之，小鼠體內的NMDA受體活性則不受影響。通過原位雜交和免疫染色的方法，證實喂食dox 5天后，iCA1-KO小鼠中的NR1基因敲除限定在海馬的CA1區(qū)，而iFB-KO小鼠中的NR1基因敲除則限

4、定在前腦區(qū)。 分別運用這兩種模型小鼠及其同窩對照組進行隱藏平臺的水迷宮任務測試。iCAl-KO及其對照組每只小鼠每天訓練4次，從水池的不同象限各入水1次，每次間隔1小時，訓練單次的時間設定為90秒，連續(xù)實驗14天，并于第8天開始給兩組小鼠喂食dox。實驗過程的第2天、第7天、第13天和第14天進行目標測試（probe test）。第1天至第13天訓練和測試時，水迷宮周圍的線索（cue）完整；第14天測試時只保留部分線索。結果發(fā)現(xiàn)

5、，對照組與iCAl-KO組小鼠隨著訓練時間的增加，逃避潛伏期（1atency）逐漸縮短，分別由第1天的77.07±2.91秒和75.86±4.53秒降至第12天的26.67±4.02秒和29.2±4.22秒；且兩組小鼠逃避潛伏期的變化趨勢一致，沒有顯著差異。在隨后進行的4天目標測試中，第2天的測試結果顯示，兩組小鼠分布在水池四個象限中的游動時間相當，均為25％左右。第7天的測試中，兩組小鼠在靶象限中的游動時間均明顯多于其他3個象限（p<

6、0.001），分別達到38.48±1.66秒和35.62±1.78秒。在第13天（喂食dox 5天）、第14天（喂食dox 6天，部分線索存在）的測試中，兩組小鼠在靶象限中的游動時間仍然明顯多于其他3個象限（p<0.001）；但兩組小鼠之間在各象限中的游動時間則沒有顯著差異。這一結果提示，在海馬CA1亞區(qū)特異性敲除NR1基因，無論是在完整線索還是在部分線索的情況下，小鼠都能正常地對已形成的空間記憶加以提取。 為探討不同腦區(qū)神經元

7、，的NMDA受體在空間記憶提取中的作用，本文又利用iFB-KO及其對照組小鼠進行水迷宮任務測試，其結果與iCAl-KO及其對照組小鼠的相似。iFB-KO及其對照組每只小鼠每天訓練4次，從水池不同象限各入水1次，每次間隔1小時，訓練單次的時間同樣設定為90秒，連續(xù)實驗16天，并于第10天開始給兩組小鼠喂食dox。實驗過程中的第2天、第7天、第15天和第16天進行目標測試。第1天至第15天訓練和測試時，水池周圍布置的線索是完整的，第16天測

8、試時則只保留部分線索。結果發(fā)現(xiàn)，隨著訓練時間的增加，對照組和iFB-KO組小鼠的逃避潛伏期逐漸縮短，分別由第1天的68.28±5.28秒和72.49±3.9秒降至第14天的29.22±6.64秒和27.2±4.27秒；且兩組小鼠逃避潛伏期的變化趨勢一致，沒有顯著差異。在隨后進行的4天目標測試中，第2天的測試數(shù)據(jù)表明，兩組小鼠分布在水池四個象限中的游動時間相當，均為25％左右。第7天的測試中，兩組小鼠在靶象限中的游動時間比在其他三個象限要

9、多，但沒有顯著差異（p>0.1）。第15天（喂食dox 5天）測試中，兩組小鼠在靶象限中的游動時間均明顯多于其他3個象限（p<0.001），分別達到35.03±2.03秒和33.65±2.1秒。第16天（喂食dox6天，保留部分線索）的測試中，兩組小鼠在靶象限中的游動時間仍然明顯多于右象限和相對象限，但與左象限的游動時間相比沒有明顯差異；同時兩組小鼠之間在各象限中的游動時間沒有明顯不同。這一結果同樣提示，在整個前腦區(qū)（皮層、海馬、紋狀體

10、等）敲除NR1基因，無論是在周圍的線索全部存在還是部分存在的情況下，與對照組小鼠相比，iFB-KO小鼠都能正常地對形成的空間記憶加以提取。 為了進一步探討NMDA受體在非陳述性記憶提取中的作用，本文還利用條件性味覺厭惡回避任務（CTA）對iFB-KO及其對照組小鼠進行了研究。實驗連續(xù)進行35天，前5天為適應期，使小鼠由自由飲水改為定時飲水。第6天飲水時間將普通水換成糖精鈉（0.1％w/v），飲水結束后40分鐘給小鼠腹腔注射LiC

11、l。其后28天恢復給予普通飲用水，并于測試前6天開始將普通鼠食換成含dox的食物。結果發(fā)現(xiàn)，僅在測試階段敲除前腦的NR1基因，兩組小鼠對水的傾向因子分別為71.27±3.76％和71.86±2.68％，沒有顯著差異。這一實驗結果再次表明，僅在測試階段敲除整個前腦的NMDA受體基因，小鼠對不依賴于海馬的味覺記憶（非陳述性記憶的一種）的提取也能正常進行。 利用可誘導、可反轉的條件基因剔除小鼠，本文首次直接研究了NMDA受體在空間記憶