RACK1條件性敲除對(duì)T細(xì)胞的影響.pdf

1、目的：探討RACK1基因?qū)π∈骉細(xì)胞發(fā)育、存活、活化、增殖等方面存在的影響。
　　方法：采用Cre-LoxP系統(tǒng)條件性敲除T細(xì)胞中的RACK1基因，得到RACK1在T細(xì)胞中特異缺失的小鼠（KO小鼠，同窩對(duì)照小鼠稱為WT小鼠）。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)某些表面標(biāo)記，如CD4，CD8，CD62L，CD44等，或者核因子Foxp3的表達(dá)水平變化，分析WT小鼠和KO小鼠T細(xì)胞在這些方面的差異。利用BrdU摻入和流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞增殖情況。利用A

2、nnexin V染色和流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡情況。構(gòu)建嵌合體小鼠，將CD45.1+CD45.2+WT小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞與CD45.1-CD45.2+的KO小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞以1：1的比例通過(guò)尾靜脈注射入清髓后的CD45.1小鼠中，分析兩種來(lái)源的T細(xì)胞在完全相同環(huán)境下，是否仍呈現(xiàn)某些方面的差異。利用免疫印跡檢測(cè)小鼠T細(xì)胞內(nèi)自噬標(biāo)志蛋白LC3BⅡ和促凋亡蛋白Bim的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：1、KO小鼠外周CD4與CD8 T細(xì)胞的比例

3、及總數(shù)與WT小鼠相比均有不同程度的下降。嵌合體小鼠的數(shù)據(jù)證明，KO小鼠中外周T細(xì)胞的減少的確是細(xì)胞內(nèi)在缺陷導(dǎo)致的結(jié)果。然而在胸腺中，RACK1缺失不影響各發(fā)育階段T細(xì)胞的總數(shù)和比例，對(duì)Tregs發(fā)育也沒(méi)有影響。KO小鼠外周T細(xì)胞沒(méi)有異常增強(qiáng)的本底活化；但在李斯特菌感染后，KO小鼠來(lái)源的外周T細(xì)胞活化情況不同于WT小鼠來(lái)源的相應(yīng)T細(xì)胞。說(shuō)明RACK1基因敲除對(duì)T細(xì)胞活化存在影響。3、BrdU摻入實(shí)驗(yàn)表明，嵌合體小鼠中KO小鼠來(lái)源的CD4

4、T細(xì)胞增殖比WT小鼠來(lái)源的CD4 T細(xì)胞低，說(shuō)明RACK1可能影響了CD4 T細(xì)胞的增殖，但在CD8 T細(xì)胞中卻沒(méi)有明顯的區(qū)別。4、RACK1基因敲除后，遷出外周的T細(xì)胞內(nèi)過(guò)多的線粒體不能被清除，伴有凋亡顯著增多。免疫印跡結(jié)果顯示，RACK1缺失影響自噬標(biāo)志性蛋白LC3B II和促凋亡蛋白Bim的蛋白量。
　　結(jié)論：在小鼠模型中，RACK1在T細(xì)胞中的特異缺失對(duì)T細(xì)胞在胸腺中的發(fā)育沒(méi)有明顯影響，但對(duì)T細(xì)胞的外周存活存在影響。其機(jī)制