Pax-8基因敲除小鼠心臟中NR4A1基因表達(dá)上調(diào).pdf

1、目的:利用基因芯片,比較Pax-8基因敲除純合子(Pax-8 KO-/-)和雜合子(Pax-8KO+/-)兩組小鼠基因表達(dá)水平,找出差異表達(dá)的基因,并經(jīng)半定量RT-PCR和熒光實(shí)時定量PCR技術(shù)初步篩選出轉(zhuǎn)錄因子Pax-8的下游基因。
　　 方法:
　　 1.Pax-8基因敲除純合子小鼠的獲得:選擇Pax-8 KO+/-20只小鼠,雌雄各10只,雌的Pax-8KO+/-和雄的Pax-8KO+/-交配可獲得Pax-8 KO

2、-/-。
　　 2.Pax-8基因敲除小鼠的基因型鑒定:提取小鼠DNA運(yùn)用PCR法鑒定小鼠基因型。
　　 3.芯片雜交和數(shù)據(jù)分析:取Pax-8 KO-/-組與Pax-8 KO+/-組出生第一天(P0)小鼠各3只,TRIzol法常規(guī)提取心臟組織總RNA,經(jīng)紫外吸收測定和變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA質(zhì)量,只有28S/18S rRNA帶密度比值為1.5-2.0且A260/A280吸收率為1.8-2.0者才繼續(xù)進(jìn)行之后的操作,參

3、照上海生物芯片有限公司試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記cDNA探針并純化,Cy3-dUTP標(biāo)記Pax-8 KO-/-cDNA,Cy5-dUTP標(biāo)記Pax-8 KO+/-cDNA,將探針加在基因芯片上,用蓋玻片封片室溫晾干,芯片結(jié)果采用Axon公司的Gene Pix4100掃描,Gene PixPro4.0軟件分析Cy3和Cy5兩種熒光信號的強(qiáng)度和比值,用以下2個條件為判斷基因差異表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn):①Cy3和Cy5信號比值>2.0為表達(dá)上調(diào),<0.5為表

4、達(dá)下調(diào),0.5-2.0為不存在顯著表達(dá)差異。②Cy3和Cy5信號比值其中之一必須>200或其中之一<800及Cy5/Cy3在0.1-10之間,作為判斷基因差異表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn),找出兩組有差異表達(dá)的基因。
　　 4.半定量RT-PCR:每組(Pax-8 KO-/-組,Pax-8 KO+/-組)各取出生第一天(P0)小鼠3只,用TRIzol試劑提取心臟組織總RNA(按TRIzol說明書操作),取每組總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),按照不同引物條件

5、進(jìn)行半定量RT-PCR。
　　 5.熒光定量RT-PCR:每組取出生第一天(P0)小鼠各3只,常規(guī)提取各只動物心臟組織總RNA作逆轉(zhuǎn)錄,用NR4A1實(shí)時定量RT-PCR引物(由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成)進(jìn)行熒光定量PCR檢測。用ABI7500 FAST型熒光定量PCR儀檢測,試驗(yàn)重復(fù)3次。通過比較△Ct的方法進(jìn)行NR4A1表達(dá)的定量分析,NR4A1的相對表達(dá)量用2-△Ct表示。Ct為每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的閾值時所歷

6、的循環(huán)數(shù),△Ct為NR4A1 Ct值與內(nèi)參Beta-actin Ct值之差。
　　 結(jié)果:
　　 1.通過基因芯片對31,802個已知基因進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)與Pax-8 KO+/-組相比,在Pax-8 KO-/-組中25個基因表達(dá)下調(diào),另外17個基因表達(dá)上調(diào),其中涉及細(xì)胞周期,直接參與代謝的酶,細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及核轉(zhuǎn)錄因子等基因。
　　 2.通過半定量RT-PCR法初步驗(yàn)證基因芯片篩選的基因發(fā)現(xiàn)NR4A1的PCR產(chǎn)物在第

7、28個PCR循環(huán)周期開始,Pax-8 KO-/-組明顯多于Pax-8 KO+/-組和Pax-8 KO-/+組。說明NR4A1基因在Pax-8 KO-/-小鼠中表達(dá)上調(diào)。
　　 3.通過熒光定量RT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)NR4A1(nuclear receptorsubfamily4,group A,member1)在Pax-8 KO-/-組比Pax-8 KO+/-組上調(diào)(1.53±0.08)倍(P<0.01),而作為內(nèi)部對照的G