加強(qiáng)型人乳頭瘤病毒16型mE7-HSP70 DNA疫苗的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、現(xiàn)已明確持續(xù)性高危型人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)感染是宮頸癌發(fā)生的主要誘因，其中由HPV16感染引起的宮頸癌占宮頸癌總數(shù)的56％。目前尚無有效的宮頸癌治療性疫苗問世，我國是宮頸癌的高發(fā)區(qū)，因此研制發(fā)針對(duì)HPV16的治療性疫苗意義重大。
　　 理想的治療性疫苗需要全面活化機(jī)體的抗瘤免疫，特別是特異性細(xì)胞免疫，因此各種免疫刺激分子在腫瘤及病毒治療性疫苗的研究中倍受重視，特別是在DNA及蛋白疫苗的應(yīng)

2、用具特別的意義。與活的重組微生物疫苗或滅活疫苗相比，該類疫苗雖然成分單一明確，安全性好，但缺乏刺激產(chǎn)生“危險(xiǎn)信號(hào)”的能力，活化固有免疫及抗原呈遞細(xì)胞(Antigenpresentingcells，APC)的能力明顯不足，因此不利于特異性免疫的有效活化。
　　 疫苗的安全性和免疫原性是研發(fā)有效疫苗時(shí)必須考慮的兩個(gè)關(guān)鍵性因素，通過引入HSP70免疫佐劑以提高DNA疫苗的免疫原性可望獲得免疫原性增強(qiáng)的腫瘤治療性DNA疫苗，該類疫苗除需

3、考慮常規(guī)DNA疫苗的安全性之外，還需兼顧佐劑分子人體應(yīng)用后可能存在的潛在危險(xiǎn)性。小鼠研究發(fā)現(xiàn)MtHSP70可誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生自身免疫性腸炎，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其原因是在體內(nèi)產(chǎn)生了HSP70的自發(fā)反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞。對(duì)人源及細(xì)菌來源的HSP70/肽復(fù)合物疫苗免疫活性的比較研究可為相應(yīng)的人用疫苗的選擇提供參考依據(jù)。
　　 本課題組在前期針對(duì)HPV16的治療性疫苗的研究工作中，聯(lián)合基因切割重排、定點(diǎn)突變及密碼子優(yōu)化等技術(shù)構(gòu)建獲得了消除了轉(zhuǎn)化活性

4、且免疫原性增強(qiáng)的HPV16E7修飾基因(mE7)，以mE7為抗原基因的HPV16治療性疫苗極具進(jìn)一步研發(fā)的價(jià)值，為此我們申請(qǐng)了國家發(fā)明專利。為了推動(dòng)以mE7為基礎(chǔ)的HPV16治療性疫苗的深入研究，本研究擬在本室構(gòu)建的常規(guī)的pVR1012-mE7/MtHSP70研究的基礎(chǔ)上，分別構(gòu)建帶外泌信號(hào)肽基因的分支結(jié)核桿菌來源的和人來源的HSP70融合mE7抗原基因的DNA疫苗pVR1012-SigmE7/MtHSP70和pVR1012-SigmE

5、7/HuHSP70，然后比較分析常規(guī)的pVR1012-mE7/MtHSP70和帶外泌信號(hào)肽基因的pVR1012-SigmE7/MtHSP70DNA疫苗免疫活性的差異，同時(shí)對(duì)人和分支結(jié)核桿菌兩種不同種屬來源的HSP70/肽復(fù)合物DNA疫苗pVR1012-SigmE7/MtHSP70和pVR1012-SigmE7/HuHSP70的免疫活性進(jìn)行比較研究。實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果如下:
　　 1.pVR1012-SigmE7/MtHSP70和pV

6、R1012-SigmE7/HuHSP70的構(gòu)建:
　　 以pVR1012-mE7重組質(zhì)粒為模板，將人CD33信號(hào)肽基因和mE7基因利用overlapPCR的方法連接在一起，獲得N末端帶信號(hào)肽的不含終止密碼子的mE7基因(SigmE7’)，酶切后將SigmE7基因和MtHSP70基因連接在一起，構(gòu)建SigmE7/MtHSP70融合基因，然后將該融合基因插入pVR1012真核表達(dá)質(zhì)粒，獲得pVR1012-SigmE7/MtHSP70

7、重組質(zhì)粒。以含有人HSP70基因的pMSHsp70為模板，利用PCR的方法得到HuHSP70基因，然后將HuHSP70和pVR1012-SigmE7/MtHSP70上的MtHSP70置換，構(gòu)建了pVR1012-SigmE7/HuHSP70，酶切鑒定和DNA測(cè)序驗(yàn)證正確。
　　 2.重組質(zhì)粒的表達(dá)鑒定:
　　 堿裂解法和聚乙二醇沉淀法大量提取并純化質(zhì)粒DNA，脂質(zhì)體2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，48小時(shí)后收集裂解液和上清

8、，BCA蛋白定量試劑盒分別對(duì)總裂解液和濃縮后的總上清蛋白進(jìn)行定量，各取1/10體積處理后的裂解液和上清上樣，檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解液和上清中的融合蛋白表達(dá)情況。結(jié)果表明pVR1012-mE7/MtHSP70、pVR1012-SigmE7/MtHSP70和pVR1012-SigmE7/HuHSP70的裂解液和上清中均發(fā)現(xiàn)相應(yīng)融合蛋白的表達(dá)，分子量分別是85，87和100kDa。細(xì)胞裂解液中的融合蛋白表達(dá)水平明顯高于上清中的表達(dá)水平，三種融合蛋白

9、在細(xì)胞裂解液中的表達(dá)水平基本一致，在上清中的表達(dá)水平也基本一致。以上結(jié)果提示常規(guī)的重組質(zhì)粒也能在胞外表達(dá)，而且和帶外泌信號(hào)肽的重組質(zhì)粒在胞外的表達(dá)水平幾乎沒有區(qū)別，三種融合蛋白的表達(dá)以細(xì)胞內(nèi)表達(dá)為主。
　　 3.動(dòng)物免疫及疫苗體外免疫活性的檢測(cè):
　　 將6-8周齡雌性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為四組，每組7只，分別用于pVR1012-mE7/MtHSP70(mE7/MtHSP70)、pVR1012-SigmE7/MtHS

10、P70(SigmE7/MtHSP70)、pVR1012-SigmE7/HuHSP70(SigmE7/HuHSP70)和生理鹽水(Normalsaline，NS)肌肉免疫。免疫前預(yù)先在每只小鼠的雙側(cè)股四頭肌內(nèi)各注射50μl布比卡因，一天后在相同部位注射50μg的質(zhì)粒DNA，7天后加強(qiáng)免疫1次，最后一次免疫后的第10天，分離小鼠脾細(xì)胞，體外經(jīng)E749-57(2μg/ml)和E730_67肽(2μg/ml)分別刺激后，ELISPOT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)分

11、泌IFN-γ的E7特異性CD8+T細(xì)胞數(shù)目；流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)E7特異性CD8+T細(xì)胞、CD4+/IFN-γ+Th1細(xì)胞和CD4+/IL-4+Th2細(xì)胞的數(shù)目；收集小鼠血清，ELISA法檢測(cè)免疫血清中E7特異性抗體水平。ELISPOT實(shí)驗(yàn)中mE7/MtHSP70，SigmE7MtHSP70，SigmE7/HuHSP70組和NS對(duì)照組中5×105個(gè)小鼠脾細(xì)胞中平均分泌IFN-γ的CD8+T細(xì)胞數(shù)目分別為503、100、651和5。流式細(xì)胞

12、術(shù)實(shí)驗(yàn)中四個(gè)組CD8+/IFN-γ+雙陽性的細(xì)胞數(shù)目分別是497、389、686和280，CD4+/IFN-γ+雙陽性和CD4+/IL-4+雙陽性細(xì)胞數(shù)目分別是385、386、389和383以及165、168、158和150。ELISA實(shí)驗(yàn)中1:20滴度時(shí)的OD490nm值分別為0.50±0.08、0.56±0.13、0.62±0.15、0，45±0.02。以上結(jié)果表明，常規(guī)的mE7/MtHSP70比帶外泌信號(hào)肽的SigmE7/MtHS

13、P70具有更高的CD8+T細(xì)胞反應(yīng)，人源性SigmE7/HuHSP70比結(jié)核桿菌源性SigmE7/MtHSP70具有更高的CD8+T細(xì)胞反應(yīng)，三組質(zhì)粒DNA疫苗幾乎沒有CD4+/IFN-γ+-Th1細(xì)胞和CD4+/IL-4+-Th2細(xì)胞介導(dǎo)的CD4+T細(xì)胞反應(yīng)，三組質(zhì)粒DNA疫苗也都沒有顯著提高E7特異性的抗體水平。
　　 4.疫苗體內(nèi)抗瘤活性的檢測(cè):
　　 腫瘤預(yù)防實(shí)驗(yàn)中，預(yù)先按上述方法進(jìn)行DNA疫苗肌肉免疫，最后一次

14、免疫后的第7天接種7.5×104個(gè)HPV16E6/E7的陽性TC-1瘤細(xì)胞，接種后的第12天時(shí)，SigmnE7/MtHSP70組的1只小鼠形成移植瘤，其它兩種質(zhì)粒組未形成移植瘤，NS對(duì)照組的7只小鼠形成移植瘤；在接種后的55天時(shí)，mE7/MtHSP70組，SigmE7/MtHSP70組和SigmE7/HuHSP70組小鼠的未成瘤率分別是100％，86％和100％。腫瘤治療實(shí)驗(yàn)中，預(yù)先接種7.5×104個(gè)TC-1細(xì)胞，3天后按上述方法進(jìn)行

15、DNA疫苗免疫。在TC-1瘤細(xì)胞接種后的14天，SigmE7/MtHSP70組的1只小鼠形成移植瘤，其它兩種質(zhì)粒組未見移植瘤形成，NS對(duì)照組的7只小鼠全部形成移植瘤；接種后的20天，mE7/MtHSP70組的1只小鼠和SigmE7/MtHSP70組的另1只小鼠形成移植瘤，SigmE7/HuHSP70組的小鼠仍未見移植瘤形成；接種后的60天，mE7/MtHSP70組，SigmE7/MtHSP70組和SigmE7/HuHSP70組小鼠的未成

16、瘤率分別是86％，71％和100％。以上結(jié)果表明常規(guī)的mE7/MtHSP70比帶外泌信號(hào)肽的SigmE7/MtHSP70具有更高的抗腫瘤活性，人源性的SigmE7/HuHSP70比結(jié)核桿菌源性的SigmE7/MtHSP70展現(xiàn)了更高的抗腫瘤活性。
　　 總之，以上結(jié)果表明，常規(guī)的mE7/MtHSP70DNA疫苗與帶外泌信號(hào)肽的HSP70相關(guān)HPV16mE7DNA疫苗相比可顯著提高E7特異性CD8+T細(xì)胞反應(yīng)和抗腫瘤活性；與結(jié)核桿