人乳頭瘤病毒16型(HPV16)藥物篩選模型的建立及藥效學(xué)評(píng)價(jià).pdf

1、宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)中常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率位居女性腫瘤的第二位，是全球最主要的癌癥之一。流行病學(xué)顯示，持續(xù)性感染高危型人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)是宮頸癌最重要的致病因素。約95％宮頸癌活組織檢查均檢測(cè)出有HPV的感染，證實(shí)了人乳頭瘤病毒(HPV)感染與宮頸癌密切相關(guān)。大約有50%和20%的宮頸癌病例分別檢測(cè)出高危型的HPV16和18，這兩種基因型的HPV在宮頸癌中的感染率最高。因此，大多數(shù)研究主

2、要是集中在HPV16和18的生物學(xué)研究上。在目前HPV治療性疫苗沒(méi)有取得突破性的進(jìn)展，預(yù)防性疫苗僅適用于部分人群的情況下，治療性藥物的研究和開(kāi)發(fā)仍然顯得很重要。而在藥物研發(fā)的最初階段，關(guān)鍵在于能否建立穩(wěn)定，快速，有效的藥物篩選模型并加以應(yīng)用。本課題主要研究的目的是建立抗HPV16藥物的篩選模型，用于抗HPV16藥物的發(fā)現(xiàn)。
　　 采用HPV16陽(yáng)性細(xì)胞Caski，以HPV16E6，E7基因?yàn)榘悬c(diǎn)，β-actin為內(nèi)參基因，提取細(xì)

3、胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行Real-timePCR，通過(guò)擴(kuò)增曲線和溶解曲線，最終確定PCR反應(yīng)條件和特異性E6，E7，β-actin引物，建立篩選抗HPV16候選物的Real-timePCR方法。
　　 以抗病毒藥物西多福韋(CDV)作為Caski細(xì)胞模型的陽(yáng)性對(duì)照藥物。CDV處理Caski細(xì)胞,48h后提取細(xì)胞內(nèi)的總RNA，通過(guò)Real-timePCR檢測(cè)E6，E7在基因水平上的變化。CDV對(duì)Ca

4、ski細(xì)胞HPV16E6mRNA表達(dá)的抑制呈劑量依賴效應(yīng)，125μg/ml和41.67μg/ml的CDV對(duì)Caski細(xì)胞HPV16E6mRNA抑制率分別為54.10%和50.27%，對(duì)E7mRNA抑制率分別為47.97%和52.75%。
　　 通過(guò)Caski細(xì)胞模型對(duì)50余個(gè)化合物和化學(xué)復(fù)方制劑進(jìn)行篩選，得到了具有抗HPV16活性的陽(yáng)性化合物L(fēng)90512-2。
　　 受試化合物L(fēng)90512-2處理Caski細(xì)胞48h后，

5、提取細(xì)胞內(nèi)的總RNA，最后進(jìn)行Real-timePCR?；衔風(fēng)90512-2對(duì)Caski細(xì)胞HPV16E6mRNA表達(dá)的抑制呈劑量依賴效應(yīng)，濃度為40μg/ml的L90512-2對(duì)Caski細(xì)胞HPV16E6和E7mRNA的表達(dá)有下調(diào)作用，抑制率分別為72.6%和77.06%。western-blotting的結(jié)果顯示濃度為40μg/ml的L90512-2對(duì)Caski細(xì)胞HPV16E6蛋白表達(dá)有下調(diào)作用，抑制率達(dá)71%。并且濃度為40

6、μg/ml，20μg/ml，10μg/ml,5μg/ml的L90512-2對(duì)Caski細(xì)胞HPV16E7蛋白的表達(dá)均有下調(diào)作用，抑制率分別為82%，81%，77%，66%。
　　 另外初步探討了化合物L(fēng)90512-2對(duì)腫瘤抑制因子p53和pRb蛋白的影響。40μg/ml的L90512-2能夠提高Caski細(xì)胞內(nèi)的p53和pRb蛋白的表達(dá)?；衔風(fēng)90512-2僅僅是通過(guò)降低E6，E7蛋白水平從而間接提高細(xì)胞內(nèi)的p53和pRb蛋白

7、水平或者是還通過(guò)其他機(jī)制來(lái)提高p53和pRb蛋白的表達(dá)，還需進(jìn)一步的深入研究。
　　 采用含HPV16病毒結(jié)構(gòu)蛋白L1和L2基因的表達(dá)質(zhì)粒和含GFP基因的報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T17細(xì)胞的方法成功制備了HPV16假病毒，并且建立了HPV16假病毒的細(xì)胞感染模型。將HPV16假病毒細(xì)胞感染模型作為篩選模型，得到了具有抗HPV16活性的復(fù)方高效碘，熒光檢測(cè)結(jié)果和western-blotting結(jié)果均顯示復(fù)方高效碘在濃度為1/24原液時(shí)

8、有較好的抑制病毒入胞的作用。
　　 初步建立了以GFP為報(bào)告基因的HPV16假病毒小鼠模型，并且采用該模型對(duì)復(fù)方高效碘的乳膏劑抗HPV16作用進(jìn)行了初步研究，結(jié)果顯示其具有抑制HPV16感染小鼠陰道上皮細(xì)胞的作用。但由于存在較大的背景熒光，今后還應(yīng)對(duì)假病毒小鼠模型的試驗(yàn)條件進(jìn)一步優(yōu)化，提高其實(shí)用性。
　　 宮頸癌的發(fā)病率在女性惡性腫瘤中位居第二位，已證持續(xù)性感染實(shí)高危型人乳頭瘤病毒(HPV)是誘發(fā)宮頸癌的主要因素，約95