Cdc20在肝細胞癌中的表達及其與肝癌發(fā)生、預(yù)后的關(guān)系.pdf

1、一、研究背景
　　肝細胞癌是一種肝臟原發(fā)的惡性腫瘤，其發(fā)病率居世界第五，而死亡率已經(jīng)排在全世界癌癥死亡原因的第三位。先天性的遺傳改變和后天的高危因子例如HBV/HCV的感染、肝硬化、酒精性肝病及黃曲霉素的污染等都是導致肝細胞癌高發(fā)的危險因素。
　　肝細胞癌經(jīng)常發(fā)生在已經(jīng)病變的肝臟，并且是肝硬化的一個致命的并發(fā)癥。對肝臟致癌原理研究的缺乏，以及對惡性轉(zhuǎn)化阻斷或逆轉(zhuǎn)的失敗，導致了肝細胞癌病人的不良預(yù)后。臨床上針對肝細胞癌的分子靶

2、向治療急需關(guān)鍵的信號通路。全基因組表達微陣列分析已經(jīng)找出了導致失控性生長和異常生存信號的一些重要通路，而部分關(guān)鍵通路已經(jīng)被驗證。但是，還沒有有意義的基因標記或預(yù)后指標進入到臨床實踐，因此需進一步研究和尋找肝細胞癌新的診斷及預(yù)后標記物。
　　已有研究表明細胞周期檢查點的破壞在肝細胞癌中是一個重要事件并且能促進腫瘤形成。絲裂原調(diào)控子20(Cdc20)是一個細胞周期檢查點的調(diào)控因子，它和另一個調(diào)控因子Cdh1都可直接結(jié)合并激活有絲分裂后

3、期促進復(fù)合物APC，在細胞進入分裂后期和退出有絲分裂過程中起重要作用。近期，越來越多的研究表明Cdc20是一個致癌因子，在多種人類惡性腫瘤中廣泛表達上調(diào)，包括胰腺導管腺癌、乳腺癌、膠質(zhì)母細胞瘤、卵巢癌及胃癌等，并且與多種腫瘤的不良預(yù)后密切相關(guān)。但是Cdc20在肝細胞癌中的研究還非常有限，其表達情況及發(fā)揮的作用和作用機制還并不十分清楚。
　　二、研究目的
　　檢測Cdc20在肝細胞癌組織中的表達情況，探討其在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的

4、作用及其與肝癌病人預(yù)后的相關(guān)性，并初步探索Cdc20在肝癌中的分子機制。
　　三、研究方法
　　1.生物信息學分析
　　用生物信息學方法分析公共基因表達數(shù)據(jù)庫GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中GSE14520芯片數(shù)據(jù)并篩選出肝癌和正常肝組織的差異表達基因，對這些基因進行GO功能分類和KEGG信號通路分析，并構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，篩選出在肝癌中起重要作用的靶基因。
　　2.靶

5、基因Cdc20在肝細胞癌組織中的表達驗證
　　用熒光定量RT-PCR及Western blot法分別檢測16對新鮮肝癌組織及癌旁正常肝組織中Cdc20的mRNA和蛋白水平。
　　3.Cdc20與肝癌病人的臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系
　　用免疫組化法在132例肝癌病人的癌組織及癌旁正常肝組織石蠟切片中檢測Cdc20的表達情況及表達部位，并分析其表達水平與臨床病理參數(shù)及總生存率的關(guān)系。
　　4.SiRNA干擾Cdc20

6、的表達并檢測沉默后對肝癌細胞生長、細胞周期、細胞遷移及下游底物的影響
　　在HepG2細胞系中用siRNA沉默Cdc20的表達，用細胞增殖曲線觀察基因沉默后對細胞生長速度的影響，流式細胞儀檢測細胞周期的改變，劃痕實驗檢測細胞遷移能力的改變。并用western blot檢測了其下游底物p21的表達改變。
　　四、研究結(jié)果
　　1.Cdc20是肝細胞癌分子作用網(wǎng)絡(luò)中重要的靶基因
　　用生物信息學方法篩選出了137個肝

7、癌中的差異表達基因并構(gòu)建了相互作用基因網(wǎng)絡(luò)圖，Cdc20在網(wǎng)絡(luò)圖中居于中心位置并與多個基因有相互作用，推測其可能是肝癌中重要的靶基因。
　　2.Cdc20在肝細胞癌組織中高表達
　　Cdc20的mRNA及蛋白水平在多數(shù)肝癌組織中均表達上調(diào)(14/16)。
　　3.Cdc20高表達與多項臨床病理參數(shù)相關(guān)
　　免疫組化檢測Cdc20在肝癌組織中表達明顯高于癌旁正常肝組織(P=0.000)，表達部位主要位于細胞核和細胞

8、質(zhì)中，并且其高表達與腫瘤的不良分化(P=0.002)及TNM分期相關(guān)(P=0.022)。
　　4.Cdc20是肝細胞癌的不良預(yù)后因子
　　分析132例病人中75例患者的總生存時間，5年總生存率為21％。Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)Cdc20表達分值(P=0.011)、腫瘤大小(P=0.000)、轉(zhuǎn)移(P=0.006)、AFP水平(P=0.032)、腫瘤分化(P=0.000)、TNM分期(P=0.003)、P53(P=0.02)及Ki6

9、7(P=0.004)的表達均與腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)，但只有腫瘤大小(P=0.000)、腫瘤分化(P=0.000)及P53的表達水平(P=0.000)為肝細胞癌獨立的預(yù)后因子。
　　5.Cdc20表達抑制后細胞生長速度及遷移能力下降，細胞周期停滯用siRNA干擾Cdc20的表達之后，HepG2細胞的生長速度減慢，處于G2/M期的細胞比例增多，但對細胞遷移能力的影響不大。檢測下游的底物分子發(fā)現(xiàn)Cdc20表達抑制后p21蛋白表達明顯增加。