SNF5在肝細胞肝癌中的表達及其與AR關系的初步研究.pdf

1、目的
　　肝細胞性肝癌(HCC)是目前我國常見的惡性腫瘤疾病之一，發(fā)病機制尚未明確。肝癌由于其發(fā)病具有隱匿性，發(fā)現時多為晚期且預后較差。且對放療的耐藥性和對化療不敏感，所以肝臟移植和肝臟切除是目前僅有的根治療法，但術后患者的5年復發(fā)率及轉移率高，已成為臨床治療的難題。因此，研究肝癌發(fā)生發(fā)展的具體機制對其預防和治療具有重要意義。
　　SNF5是染色質重塑復合物SWI/SNF的核心亞基，在一些惡性腫瘤的研究中發(fā)現其在腫瘤的發(fā)生發(fā)

2、展中扮演重要角色，但其在肝癌中的表達情況及其是否有可能參與調控肝癌的發(fā)生發(fā)展，現未有報道。SWI/SNF復合物利用ATP水解釋放的能量使組蛋白和DNA的構象發(fā)生局部改變，有助于轉錄因子與靶基因的啟動子結合，從而激活或者抑制靶基因的轉錄。哺乳動物SWI/SNF復合物由9～12個亞基組成，分為三類:1)ATP酶亞基（BRG1或BRM）;2）核心亞基(hSNF5，BAF155和BAF170);3）副亞基(BAF53，BAF57，BAF180)

3、等。SNF5是該復合物進化上高度保守的核心亞單位之一，為染色質重塑功能不可或缺。SNF5是一個腫瘤抑制因子。研究發(fā)現其遺傳學的證據是大多數的惡性橫紋肌樣瘤中包含SNF5基因位點的雙等位基因失活性突變。在橫紋肌肉瘤細胞中SNF5的缺失或失活引起AuroraA的高表達，從而使細胞有絲分裂紡錘體位點的異常。SNF5缺失也可通過下調p16INK4或者誘導了因子p21CIP1/WAF1，上調CyclinD1表達從而阻斷RB信號通路，促進腫瘤的發(fā)生

4、發(fā)展。當干擾SWI/SNF復合物時，會導致侵襲性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。
　　雄激素受體(AR)基因位于X染色體長臂Xqll.2-ql2，存在于這個基因上編碼序列分為8個外顯子，它被轉錄、加工成mRNA，并進一步被譯成蛋白質。AR的結構包括羧基端配體結合區(qū)、DNA結合區(qū)、鉸鏈區(qū)、可變長度CAG重復區(qū)、氨基端激活區(qū)。鉸鏈區(qū)與激素結合后發(fā)揮受體-激素復合物的核內功能，配體結合區(qū)的區(qū)域在相關分子的作用下，可以提高與激素的親和力。AR的作用機制:

5、在胞質中，AR與熱休克蛋白(heatshockprotein，Hsp)結合，AR與配體（如雄激素）結合后被激活，Hsp解離，形成二聚體，AR二聚體轉移到細胞核中并與其轉錄輔助調控因子形成復合物，招募到雄激素反應元件（androgenresponseelementARE）區(qū)，激活其下游靶基因的轉錄。研究表明AR信號通路可促進HCC的發(fā)生。男性乙肝病毒攜帶者HCC的發(fā)病與雄激素水平的升高有關性。敲除AR表達能夠延緩化學致癌物二乙基亞硝胺(D

6、EN)誘導的雄鼠HCC發(fā)生。在DEN誘導雌鼠HCC腫瘤細胞中，AR表達升高。與正常肝組織相比，人HCC組織AR的mRNA及蛋白表達均升高。雄激素受體信號通路的活化能夠誘導下游靶基因ID1、TGF-β、VEGF等的表達，促進HCC細胞的生長、侵襲和轉移等。雄激素陽性的肝癌預后較雄激素陰性差。因此，研究AR在HCC中作用的具體機制，將為臨床的診斷提供研究依據。
　　本課題旨在深入研究SNF5蛋白在肝癌的發(fā)生、發(fā)展及臨床特征之間的關系，

7、并對HCC中AR的關系進行初步研究，期待從分子生物學水平探討SNF5蛋白作為肝癌檢測標記的可行性。
　　方法
　　一、SNF5在HCC臨床組織標本中的表達
　　1、用Westernblot實驗檢測SNF5在HCC臨床組織標本中的表達情況。
　　2、免疫組化實驗檢測SNF5在HCC臨床組織標本中的表達情況。
　　二、SNF5和AR在HCC細胞中的表達及定位
　　1、用Westernblot實驗檢測SNF

8、5和AR在肝正常細胞及肝癌細胞中的表達。
　　2、共焦激光掃描顯微鏡觀察SNF5與AR的定位。
　　三、SNF5基因克隆及真核表達質粒的構建
　　1、獲得SNF5編碼序列。
　　2、重組質粒的酶切與鑒定。
　　結果
　　一、SNF5在HCC中的表達
　　1、SNF5在HCC組織中表達低于癌周正常組織。
　　2、在肝正常細胞HL-7702及HCC細胞HepG2、Hep3B、SMMC-7721

9、和MHCC-LM3細胞中，SNF5均有表達。
　　二、SNF5和AR在HCC細胞中的表達及定位
　　1、在HCC細胞中，在無雄激素(DHT)條件下，SNF5在細胞核、細胞質中均有表達。
　　2、在HCC細胞中，在DHT刺激后，SNF5在細胞核、細胞質中均有表達，并且與AR共定位在核內。
　　三、SNF5基因克隆及真核表達質粒的構建
　　克隆了SNF5的表達序列并構建了其真核表達質粒。
　　結論