乙肝相關肝細胞癌FFPE組織及血清中microRNA表達及其與肝癌預后的研究.pdf

1、肝細胞癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一,其導致的死亡為全球所有癌癥導致死亡的第3位。在亞洲和非洲,乙肝感染是導致肝癌的主要原因。肝癌患者大多是在慢性肝病的基礎之上發(fā)展為肝癌。因此,對于肝癌的治療應該既要針對肝癌也要針對慢性肝病。手術切除依然是目前肝癌患者獲得長期生存的主要手段,然而手術切除對于肝癌病人來說并不意味著治愈,因為術后還有較高的復發(fā)轉移率。轉移復發(fā)己成為影響肝癌患者術后長

2、期生存的主要障礙。目前研究發(fā)現(xiàn)肝癌術后的復發(fā)可分為早期復發(fā)和晚期復發(fā),早期復發(fā)是指根治術后2年之內的復發(fā),被認為是由原發(fā)腫瘤播散所致;晚期復發(fā)是指根治術后2年之后的復發(fā),被認為是再生的腫瘤。顯然,這兩種類型的復發(fā)需要不同的干預策略。而將兩類不同原因導致的復發(fā)區(qū)分開是實施相應干預策略的基礎。遺憾的是目前還沒有有效的分子標記物能將早期復發(fā)和晚期復發(fā)區(qū)分開。因此,發(fā)現(xiàn)區(qū)分早期復發(fā)和晚期復發(fā)的標記物成為了一項緊迫的任務。
　　microR

3、NA是一類長約18～22nt的非編碼RNA,它們通過與mRNA的3'UTR結合達到轉錄后調控的目的,從而影響基因的表達。microRNA的失調廣泛存在于乙肝感染及惡性腫瘤等很多人類疾病中,研究也表明這種失調可能參與了惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,有人甚至認為microRNA的失調是惡性腫瘤的特征之一。microRNA已被發(fā)現(xiàn)在癌癥發(fā)生的多個步驟中以癌基因或者抑癌基因的形式參與其中。此外,microRNA的失調也可能成為疾病診斷、治療甚至預后相關

4、的分子標記物。而且有研究發(fā)現(xiàn)用microRNA對惡性腫瘤進行分型較mRNA更準確。因此,本研究擬通過TaqManLow-DensityArray(TLDA)篩選出在乙肝感染及肝癌中差異表達的microRNA及與肝癌早期復發(fā)相關的microRNA并在此基礎之上探討其作為分子標記物的可能,并為下一步其在疾病發(fā)生、發(fā)展中所起作用的功能研究及進一步發(fā)展相應的治療策略奠定一定的基礎。
　　第一部分
　　乙肝患者血清中及肝癌患者FFPE

5、樣本中顯微切割肝細胞
　　microRNA實時定量PCR內參基因的研究
　　本研究通過從TLDA分析中篩選出候選microRNA,后在更多樣本中用實時定量PCR驗證以明確乙肝患者血清中及肝癌患者石蠟樣本中顯微切割肝細胞microRNA實時定量PCR研究中合適的內參基因,并分析肝臟特異性的microRNA-miR-122在乙肝患者血清及從石蠟樣本中顯微切割的肝細胞中的表達。
　　我們分別將10例乙肝患者及10例健康人血清

6、等體積混合抽提總RNA后用TLDA檢測后挑選出與其均數(shù)相近的microRNA,在52例乙肝患者血清及57例健康人血清中檢測這些microRNA和目前被用做循環(huán)microRNA內參的基因,并用geNorm和NormFinder軟件分析出最合適的內參基因組合。用實時定量PCR技術在乙肝患者血清及顯微切割的乙肝感染肝細胞和正常肝細胞中檢測miR-122的表達。
　　結果發(fā)現(xiàn)miR-26a、miR-22*和IniR-221是乙肝患者血清m

7、icroRNA實時定量PCR研究最合適的內參基因組合。miR-122在乙肝患者血清中顯著升高。
　　而用同樣的方法我們發(fā)現(xiàn)miR-103和miR-191是從福爾馬林固定石蠟包埋(formalin-fixedparaffinembedded,FFPE)肝癌樣本中顯微切割的肝癌細胞及癌周非癌肝細胞中microRNA實時定量PCR研究最合適的內參基因組合。
　　第二部分
　　乙肝及肝癌患者血清及FFPE組織中差異microR

8、NA的研究
　　本研究采用激光捕獲顯微切割9例乙肝患者肝組織石蠟樣本中的肝細胞、8例無肝炎病毒感染的肝細胞、24例肝癌FFPE樣本中癌細胞及癌周非癌肝細胞并提取總RNA。在乙肝感染的肝細胞和無肝炎病毒感染的肝細胞間檢測miR-122的表達,而在癌細胞及癌周非癌肝細胞間檢測差異表達的microRNA。然后,在乙肝及肝癌患者血清中檢測肝癌細胞與癌周非癌肝細胞差異表達microRNA的表達并分析其差異。探討肝癌患者石蠟樣本中顯微切割的癌

9、細胞和癌周非癌肝細胞中差異表達的micmRNA及這些差異microRNA在乙肝及肝癌患者血清中的表達情況以及乙肝感染肝細胞與無肝炎病毒感染肝細胞中miR-122表達的差異情況。
　　結果發(fā)現(xiàn)miR-22*、miR-26a及miR-122在肝癌細胞中的表達顯著低于癌周非癌肝細胞,而僅有miR-22*在肝癌患者血清中表達較乙肝患者高,其余microRNA在兩組間無差異表達。miR-122卻在乙肝感染的肝細胞中顯著降低,與乙肝感染患者血

10、清中miR-122的改變趨勢相反。
　　第三部分
　　FFPE組織中肝癌早期復發(fā)相關microRNA的研究
　　本研究通過TLDA篩選出與肝癌早期復發(fā)相關的microRNA,并在大樣本中驗證該結果,然后探討其與肝癌預后的關系及作為肝癌早期復發(fā)預測分子標記物的可能。
　　我們分別將10例顯微切割肝癌細胞及10例癌周非癌肝細胞的總RNA等濃度混合后用TLDA檢測后挑選出在早期復發(fā)及無早期復發(fā)組之間差異表達的micro

11、RNA,在訓練組(106例)及測試組(112例)中檢測差異microRNA的表達。并分析其與肝癌預后的關系及其作為肝癌早期復發(fā)分子標記物的研究。
　　結果發(fā)現(xiàn)肝癌細胞中的miR-29a*在早期復發(fā)組較無早期復發(fā)組顯著高表達,且高表達miR-29a*者有較短的至復發(fā)時間。
　　結論
　　1.miR-26a、miR-22*及miR-221是乙肝患者血清microRNA實時定量PCR研究最合適的內參基因組合,U6作為乙肝患者

12、血清microRNA實時定量PCR研究的內參基因可能錯誤解釋實驗結果。
　　2.miR-122在乙肝患者血清中較健康人顯著高表達,而miR-122在乙肝感染的肝細胞中則較健康肝細胞顯著低表達。肝細胞中某些microRNA的異?？赡茉谘錷icroRNA中存在相反趨勢的改變。
　　3.miR-103及miR-191是乙肝相關肝癌患者顯微切割FFPE樣本中microRNA實時定量PCR.研究最合適的內參基因組合,而let-7a作

13、為乙肝患者血清microRNA實時定量PCR研究的內參基因可能會錯誤解釋實驗結果。
　　4.miR-22*,miR-26a,miR-122在顯微切割的肝癌細胞中的表達水平顯著低于癌周非癌肝細胞。miR-22*在乙肝患者血清中的表達水平顯著低于肝癌患者血清中的水平。
　　5.肝癌細胞中的miR-29a*可能是預測肝癌患者術后早期復發(fā)的分子標記物。創(chuàng)新點
　　1.首次報道了miR-26a、miR-22*及miR-221是乙

14、肝患者血清microRNA實時定量PCR研究最合適的內參基因組合,而U6并不適合作為乙肝患者血清microRNA實時定量PCR研究的內參基因。
　　2.首次報道了在人組織及血清中miR-122的反向變化關系。
　　3.首次報道了miR-103及miR-191是乙肝相關肝癌患者顯微切割FFPE樣本中microRNA實時定量PCR研究最合適的內參基因組合,而let-7a并不適合作為乙肝患者血清microRNA實時定量PCR研究的

15、內參基因。
　　4.首次報道了miR-22*在肝癌患者血清中的表達顯著高于乙肝患者血清中的表達。
　　5.首次報道了miR-29a*在早期復發(fā)的肝癌細胞中高表達,及其可能成為早期復發(fā)的分子標簽。
　　潛在應用價值
　　1.肝癌細胞中miR-29a*的表達水平可以預測肝癌患者的預后。
　　2.對miR-029a*在肝癌早期復發(fā)中機理的研究可能為預防肝癌患者根治術后早期復發(fā)提供新的干預策略。
　　3.血清