乙肝相關(guān)肝細(xì)胞癌FFPE組織及血清中microRNA表達(dá)及其與肝癌預(yù)后的研究.pdf

1、肝細(xì)胞癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一,其導(dǎo)致的死亡為全球所有癌癥導(dǎo)致死亡的第3位。在亞洲和非洲,乙肝感染是導(dǎo)致肝癌的主要原因。肝癌患者大多是在慢性肝病的基礎(chǔ)之上發(fā)展為肝癌。因此,對于肝癌的治療應(yīng)該既要針對肝癌也要針對慢性肝病。手術(shù)切除依然是目前肝癌患者獲得長期生存的主要手段,然而手術(shù)切除對于肝癌病人來說并不意味著治愈,因?yàn)樾g(shù)后還有較高的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率。轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)己成為影響肝癌患者術(shù)后長

2、期生存的主要障礙。目前研究發(fā)現(xiàn)肝癌術(shù)后的復(fù)發(fā)可分為早期復(fù)發(fā)和晚期復(fù)發(fā),早期復(fù)發(fā)是指根治術(shù)后2年之內(nèi)的復(fù)發(fā),被認(rèn)為是由原發(fā)腫瘤播散所致;晚期復(fù)發(fā)是指根治術(shù)后2年之后的復(fù)發(fā),被認(rèn)為是再生的腫瘤。顯然,這兩種類型的復(fù)發(fā)需要不同的干預(yù)策略。而將兩類不同原因?qū)е碌膹?fù)發(fā)區(qū)分開是實(shí)施相應(yīng)干預(yù)策略的基礎(chǔ)。遺憾的是目前還沒有有效的分子標(biāo)記物能將早期復(fù)發(fā)和晚期復(fù)發(fā)區(qū)分開。因此,發(fā)現(xiàn)區(qū)分早期復(fù)發(fā)和晚期復(fù)發(fā)的標(biāo)記物成為了一項(xiàng)緊迫的任務(wù)。
　　microR

3、NA是一類長約18～22nt的非編碼RNA,它們通過與mRNA的3'UTR結(jié)合達(dá)到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的目的,從而影響基因的表達(dá)。microRNA的失調(diào)廣泛存在于乙肝感染及惡性腫瘤等很多人類疾病中,研究也表明這種失調(diào)可能參與了惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,有人甚至認(rèn)為microRNA的失調(diào)是惡性腫瘤的特征之一。microRNA已被發(fā)現(xiàn)在癌癥發(fā)生的多個步驟中以癌基因或者抑癌基因的形式參與其中。此外,microRNA的失調(diào)也可能成為疾病診斷、治療甚至預(yù)后相關(guān)

4、的分子標(biāo)記物。而且有研究發(fā)現(xiàn)用microRNA對惡性腫瘤進(jìn)行分型較mRNA更準(zhǔn)確。因此,本研究擬通過TaqManLow-DensityArray(TLDA)篩選出在乙肝感染及肝癌中差異表達(dá)的microRNA及與肝癌早期復(fù)發(fā)相關(guān)的microRNA并在此基礎(chǔ)之上探討其作為分子標(biāo)記物的可能,并為下一步其在疾病發(fā)生、發(fā)展中所起作用的功能研究及進(jìn)一步發(fā)展相應(yīng)的治療策略奠定一定的基礎(chǔ)。
　　第一部分
　　乙肝患者血清中及肝癌患者FFPE

5、樣本中顯微切割肝細(xì)胞
　　microRNA實(shí)時定量PCR內(nèi)參基因的研究
　　本研究通過從TLDA分析中篩選出候選microRNA,后在更多樣本中用實(shí)時定量PCR驗(yàn)證以明確乙肝患者血清中及肝癌患者石蠟樣本中顯微切割肝細(xì)胞microRNA實(shí)時定量PCR研究中合適的內(nèi)參基因,并分析肝臟特異性的microRNA-miR-122在乙肝患者血清及從石蠟樣本中顯微切割的肝細(xì)胞中的表達(dá)。
　　我們分別將10例乙肝患者及10例健康人血清

6、等體積混合抽提總RNA后用TLDA檢測后挑選出與其均數(shù)相近的microRNA,在52例乙肝患者血清及57例健康人血清中檢測這些microRNA和目前被用做循環(huán)microRNA內(nèi)參的基因,并用geNorm和NormFinder軟件分析出最合適的內(nèi)參基因組合。用實(shí)時定量PCR技術(shù)在乙肝患者血清及顯微切割的乙肝感染肝細(xì)胞和正常肝細(xì)胞中檢測miR-122的表達(dá)。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-26a、miR-22*和IniR-221是乙肝患者血清m

7、icroRNA實(shí)時定量PCR研究最合適的內(nèi)參基因組合。miR-122在乙肝患者血清中顯著升高。
　　而用同樣的方法我們發(fā)現(xiàn)miR-103和miR-191是從福爾馬林固定石蠟包埋(formalin-fixedparaffinembedded,FFPE)肝癌樣本中顯微切割的肝癌細(xì)胞及癌周非癌肝細(xì)胞中microRNA實(shí)時定量PCR研究最合適的內(nèi)參基因組合。
　　第二部分
　　乙肝及肝癌患者血清及FFPE組織中差異microR

8、NA的研究
　　本研究采用激光捕獲顯微切割9例乙肝患者肝組織石蠟樣本中的肝細(xì)胞、8例無肝炎病毒感染的肝細(xì)胞、24例肝癌FFPE樣本中癌細(xì)胞及癌周非癌肝細(xì)胞并提取總RNA。在乙肝感染的肝細(xì)胞和無肝炎病毒感染的肝細(xì)胞間檢測miR-122的表達(dá),而在癌細(xì)胞及癌周非癌肝細(xì)胞間檢測差異表達(dá)的microRNA。然后,在乙肝及肝癌患者血清中檢測肝癌細(xì)胞與癌周非癌肝細(xì)胞差異表達(dá)microRNA的表達(dá)并分析其差異。探討肝癌患者石蠟樣本中顯微切割的癌

9、細(xì)胞和癌周非癌肝細(xì)胞中差異表達(dá)的micmRNA及這些差異microRNA在乙肝及肝癌患者血清中的表達(dá)情況以及乙肝感染肝細(xì)胞與無肝炎病毒感染肝細(xì)胞中miR-122表達(dá)的差異情況。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-22*、miR-26a及miR-122在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)顯著低于癌周非癌肝細(xì)胞,而僅有miR-22*在肝癌患者血清中表達(dá)較乙肝患者高,其余microRNA在兩組間無差異表達(dá)。miR-122卻在乙肝感染的肝細(xì)胞中顯著降低,與乙肝感染患者血

10、清中miR-122的改變趨勢相反。
　　第三部分
　　FFPE組織中肝癌早期復(fù)發(fā)相關(guān)microRNA的研究
　　本研究通過TLDA篩選出與肝癌早期復(fù)發(fā)相關(guān)的microRNA,并在大樣本中驗(yàn)證該結(jié)果,然后探討其與肝癌預(yù)后的關(guān)系及作為肝癌早期復(fù)發(fā)預(yù)測分子標(biāo)記物的可能。
　　我們分別將10例顯微切割肝癌細(xì)胞及10例癌周非癌肝細(xì)胞的總RNA等濃度混合后用TLDA檢測后挑選出在早期復(fù)發(fā)及無早期復(fù)發(fā)組之間差異表達(dá)的micro

11、RNA,在訓(xùn)練組(106例)及測試組(112例)中檢測差異microRNA的表達(dá)。并分析其與肝癌預(yù)后的關(guān)系及其作為肝癌早期復(fù)發(fā)分子標(biāo)記物的研究。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞中的miR-29a*在早期復(fù)發(fā)組較無早期復(fù)發(fā)組顯著高表達(dá),且高表達(dá)miR-29a*者有較短的至復(fù)發(fā)時間。
　　結(jié)論
　　1.miR-26a、miR-22*及miR-221是乙肝患者血清microRNA實(shí)時定量PCR研究最合適的內(nèi)參基因組合,U6作為乙肝患者

12、血清microRNA實(shí)時定量PCR研究的內(nèi)參基因可能錯誤解釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　2.miR-122在乙肝患者血清中較健康人顯著高表達(dá),而miR-122在乙肝感染的肝細(xì)胞中則較健康肝細(xì)胞顯著低表達(dá)。肝細(xì)胞中某些microRNA的異?？赡茉谘錷icroRNA中存在相反趨勢的改變。
　　3.miR-103及miR-191是乙肝相關(guān)肝癌患者顯微切割FFPE樣本中microRNA實(shí)時定量PCR.研究最合適的內(nèi)參基因組合,而let-7a作

13、為乙肝患者血清microRNA實(shí)時定量PCR研究的內(nèi)參基因可能會錯誤解釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　4.miR-22*,miR-26a,miR-122在顯微切割的肝癌細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著低于癌周非癌肝細(xì)胞。miR-22*在乙肝患者血清中的表達(dá)水平顯著低于肝癌患者血清中的水平。
　　5.肝癌細(xì)胞中的miR-29a*可能是預(yù)測肝癌患者術(shù)后早期復(fù)發(fā)的分子標(biāo)記物。創(chuàng)新點(diǎn)
　　1.首次報道了miR-26a、miR-22*及miR-221是乙

14、肝患者血清microRNA實(shí)時定量PCR研究最合適的內(nèi)參基因組合,而U6并不適合作為乙肝患者血清microRNA實(shí)時定量PCR研究的內(nèi)參基因。
　　2.首次報道了在人組織及血清中miR-122的反向變化關(guān)系。
　　3.首次報道了miR-103及miR-191是乙肝相關(guān)肝癌患者顯微切割FFPE樣本中microRNA實(shí)時定量PCR研究最合適的內(nèi)參基因組合,而let-7a并不適合作為乙肝患者血清microRNA實(shí)時定量PCR研究的

15、內(nèi)參基因。
　　4.首次報道了miR-22*在肝癌患者血清中的表達(dá)顯著高于乙肝患者血清中的表達(dá)。
　　5.首次報道了miR-29a*在早期復(fù)發(fā)的肝癌細(xì)胞中高表達(dá),及其可能成為早期復(fù)發(fā)的分子標(biāo)簽。
　　潛在應(yīng)用價值
　　1.肝癌細(xì)胞中miR-29a*的表達(dá)水平可以預(yù)測肝癌患者的預(yù)后。
　　2.對miR-029a*在肝癌早期復(fù)發(fā)中機(jī)理的研究可能為預(yù)防肝癌患者根治術(shù)后早期復(fù)發(fā)提供新的干預(yù)策略。
　　3.血清