大鼠TGFβⅡ型受體胞外區(qū)與IFN-γ融合蛋白表達及其抗大鼠肝纖維化的實驗研究.pdf

1、肝纖維化是指肝細胞發(fā)生壞死及炎癥刺激時，肝臟內(nèi)纖維結(jié)締組織異常增生的病理過程，其主要的病理特征為細胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)在肝Disse間隙的過度沉積。活化的肝星狀細胞(hepaticstellatecell，HSC)是肝纖維化發(fā)生時主要的ECM合成細胞，其活化過程主要由轉(zhuǎn)化生長因子TGFβ介導(dǎo)。因而TGFβ/HSC軸作為潛在的抗肝纖維化治療靶點，受到眾多研究者重視。TGFβ發(fā)揮生物學(xué)作用須與細胞表面T

2、GFβ受體(TβR)結(jié)合。而缺陷型TGFβⅡ型受體(dominant-negativeTβR)、可溶性TβRⅡ(solubleTGFβRⅡ，sTβRⅡ)的共同點是均可結(jié)合TGFβ而不能啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。另有研究表明，IFN-γ在體外及體內(nèi)實驗中均抑制HSC活化、減輕動物肝纖維化程度，其機制為通過JAK/STAT途徑誘導(dǎo)Smad7表達、抑制TGFβ受體復(fù)合物與Smad3的相互作用，從而間接抑制TGFβ生物學(xué)活性、抑制HSC活化。因而sTβRⅡ

3、和IFN-γ能在不同位點阻斷TGFβ1的生物學(xué)活性、抑制HSC活化，兩者聯(lián)合應(yīng)用可能在抗肝纖維化中具有潛在的協(xié)同作用，并因減少了各自用量而降低副作用。 細胞因子重組融合蛋白是一類利用基因工程的方法將編碼細胞因子和其他有特定功能的蛋白分子基因序列連接并表達相應(yīng)蛋白質(zhì)融合產(chǎn)物，其生物學(xué)活性較各單體大大增強。 為探討sTβRⅡ和IFN-γ在抗肝纖維化中潛在的協(xié)同作用及融合表達對細胞因子活性的增強作用，本研究在國內(nèi)外首次構(gòu)建了穩(wěn)

4、定表達大鼠TGFβⅡ型受體胞外區(qū)與IFN-γ融合蛋白(ratsolublesTβRⅡ-IFN-γ，RsTβRⅡ-IFN-γ)的原核表達系統(tǒng)，并大量擴增、純化融合蛋白以及鑒定它的生物學(xué)活性。通過融合蛋白體內(nèi)抗大鼠肝纖維化的實驗研究證明大鼠sTβRⅡ(ratsolubleTGFβRⅡ，RsTβRⅡ)和大鼠IFN-γ(ratIFN-γ，RIFN-γ)融合表達可使兩者發(fā)揮一定的協(xié)同作用，為新型抗肝纖維化藥物研究奠定了基礎(chǔ)。下文中sTβRⅡ和IF

5、N-γ除特別注明外，均為大鼠來源。 PartⅠ.大鼠sTβRⅡ-IFN-γ融合蛋白原核表達、純化及生物學(xué)活性鑒定本研究以已在CHO細胞中成功表達RsTβRⅡ-IFN-γ融合蛋白的pSecTag2/RsTβRⅡ-IFN-γ真核表達載體為模板用PCR擴增RsTβRⅡ-IFN-γ融合片段，并將編碼RsTβRⅡ-IFN-γ的序列亞克隆至pET44原核表達載體，轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細菌，抽提pET-44a(+)/RsTβRⅡ-IFN-γ重組

6、體質(zhì)粒DNA，經(jīng)酶切鑒定后，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細菌，用IPTG誘導(dǎo)表達RsTβRⅡ-IFN-γ融合蛋白，并分別采用WesternBlotting和ELISA方法檢測RsTβRⅡ-IFN-γ融合蛋白，證實其中含有可同時與RsTβRⅡ抗體和RIFN-γ抗體發(fā)生特異性反應(yīng)的目的蛋白。為了獲得純度較高的RsTβRⅡ-IFN-γ融合蛋白，本研究對此融合蛋白進行了純化。 為檢驗該融合蛋白的RsTβRⅡ和RIFN-γ的生物學(xué)活性，分

7、別采用抗TGFβ1增殖抑制實驗和抗病毒活性實驗。在實驗中，TGFβ1對CCL-64細胞增殖抑制作用可被RsTβRⅡ-IFN-γ融合蛋白拮抗，且具有濃度依賴關(guān)系，證明RsTβRⅡ-IFN-γ融合蛋白具有sTβRⅡ的生物學(xué)活性；在抗病毒活性實驗中，無RsTβRⅡ-IFN-γ保護的L929細胞在一定濃度的VSV攻擊下24小時內(nèi)即出現(xiàn)典型的病毒感染跡象，而經(jīng)RsTβRⅡ-IFN-γ融合蛋白預(yù)先處理的L929細胞抵御VSV攻擊的能力大為增強，且R

8、sTβRⅡ-IFN-γ保護力與其濃度有依賴關(guān)系。說明RsTβRⅡ-IFN-γ融合蛋白具有IFN-γ的抗病毒活性。 結(jié)論：本研究成功構(gòu)建了表達大鼠sTβRⅡ-IFN-γ融合蛋白的原核表達質(zhì)粒pET-44a(+)/RsTβRⅡ-IFN-γ，并在原核細胞中表達出同時具有RsTβRⅡ和RIFN-γ生物學(xué)活性的重組融合蛋白RsTβRⅡ-IFN-γ。純化了重組RsTβRⅡ-IFN-γ融合蛋白、RsTβRⅡ蛋白，且純化后蛋白的生物學(xué)活性沒有破

9、壞。 PartⅡ.大鼠sTβRⅡ-IFN-γ融合蛋白抗大鼠肝纖維化的實驗研究為進一步研究RsTβRⅡ-IFN-γ重組融合蛋白的體內(nèi)抗肝纖維化作用，采用融合蛋白直接肌肉注射的方法治療四氯化碳(tetrachloridecarbon，CCl4)誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型，觀察RsTβRⅡ/RIFN-γ在體內(nèi)抗肝纖維化中可能具有的協(xié)同作用。 首先用四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)建立了大鼠持續(xù)性肝纖維化模型，該方法操作較膽管結(jié)扎(BDL)

10、簡便，費用低，病變典型。預(yù)實驗中，大鼠給予皮下注射50％CCl4(茶油配制)、0.3ml/100g體重、每周2次、連續(xù)8周，停止給藥行肝臟組織病理學(xué)檢查，見大鼠肝臟呈現(xiàn)明顯纖維化改變，且停止CCl4給藥5周后，再行組織病理學(xué)檢查肝纖維化程度未見明顯減輕，表明CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化持續(xù)時間較長，自愈現(xiàn)象不明顯，纖維化模型合格。正式實驗中我們沿用了同樣的方法誘導(dǎo)大鼠肝纖維化。 在動物模型建立以后，將其隨機分組后分別給予RsTβRⅡ-

11、IFN-γ重組融合蛋白、RIFN-γ和RsTβRⅡ蛋白、RIFN-γ+RsTβRⅡ蛋白治療，并以未處理的肝纖維化組和正常組大鼠為對照。 治療結(jié)束后兩周處死所有大鼠，取肝臟做HE染色、膠原天狼紅染色，并用免疫組織化學(xué)、WesternBlotting、熒光定量RT-PCR檢測肝組織中Ⅲ型膠原、α-SMA、TGFβ1、TβRⅡ等分子的表達。結(jié)果顯示，RsTβRⅡ-IFN-γ重組融合蛋白治療組這四種蛋白的含量及其mRNA的表達量均明顯少

12、于其余各組。更直接的肝臟組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示RsTβRⅡ-IFN-γ治療組肝纖維化程度較其余各組明顯減輕，說明RsTβRⅡ/RIFN-γ融合表達較單獨RsTβRⅡ、RIFN-γ或RsTβRⅡ與RIFN-γ混合應(yīng)用具有更顯著的抗肝纖維化作用，證明RsTβRⅡ/RIFN-γ融合表達在抗HSC活化、減少其ECM蛋白表達及抗肝纖維化中具有協(xié)同作用。 結(jié)論：用RsTβRⅡ-IFN-γ融合蛋白治療大鼠肝纖維化，能明顯減少CCl4誘導(dǎo)的大鼠