化濁解毒調(diào)肝方對(duì)肝纖維化大鼠TGFβⅡ型受體及smad4蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)通過(guò)無(wú)菌未滅活的豬血清腹腔注射的方法制備肝纖維化大鼠模型，探討化濁解毒調(diào)肝方抗大鼠肝纖維化的作用及其可能的機(jī)制，為肝纖維化的治療提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。主要內(nèi)容包括:觀察化濁解毒調(diào)肝方對(duì)肝纖維化大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)的影響；化濁解毒調(diào)肝方對(duì)肝纖維化大鼠肝組織TGFβII型受體（TβRII）Mrna表達(dá)的影響；化濁解毒調(diào)肝方對(duì)肝纖維化大鼠肝組織smad4蛋白表達(dá)的影響。
　　 方法：清潔級(jí)Wistar大鼠50只，雄性，體重2

2、00-220g。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機(jī)抽取10只作為正常組。造模成功后將剩余40只大鼠隨機(jī)分為：模型對(duì)照組、秋水仙堿組（簡(jiǎn)稱(chēng)西藥治療組）、化濁解毒調(diào)肝方高劑量組（HZG）、化濁解毒調(diào)肝方低劑量組(HZD)，每組10只。各組均普通顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水和進(jìn)食，分籠飼養(yǎng)于20±2℃，濕度65％±5％清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)。除正常對(duì)照組外，其余40只均采用未滅活的豬血清腹腔注射，每次0.5ml/只，固定時(shí)間為周一、周五上午9點(diǎn)，每周進(jìn)行兩次，連續(xù)8

3、周。秋水仙堿治療組和中藥治療組于造模的第8 周末給藥，化濁解毒調(diào)肝方低劑量組給予含1.5g/ml 生藥水煎劑灌胃；化濁解毒調(diào)肝方高劑量組給予含3.0g/ml 生藥水煎劑灌胃；秋水仙堿組給予0.154g/kg·d灌胃，均至12周末。每天上午灌胃一次，每次3ml，連續(xù)4 周。正常對(duì)照組與模型組給予等量生理鹽水灌胃。
　　 于第12 周末處死大鼠，留取大鼠肝組織，采用蘇木精-伊紅染色和Masson染色（膠原纖維特殊染色法）觀察肝組織病

4、理形態(tài)學(xué)的變化。采用RT-PCR技術(shù)測(cè)定肝組織TGFβII型受體（以下簡(jiǎn)稱(chēng)TβRII）Mrna 表達(dá)情況，采用免疫印跡法(Western-immunoblotting）測(cè)定大鼠肝組織中smad4蛋白的表達(dá)，所得數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)整理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。兩個(gè)樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)比較行完全隨機(jī)設(shè)計(jì)單因素方差分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.一般情況：正常對(duì)照組大鼠食欲佳，被毛光

5、滑，精神狀態(tài)好，體重增加。模型組大鼠精神萎靡，活動(dòng)減少，食欲減退，消瘦，皮毛無(wú)光澤，體重較前有所下降，進(jìn)食較正常組少、尿黃，有的大鼠鼻有出血。西藥治療組及中藥治療各組大鼠精神、食欲及活動(dòng)介于正常組與模型組之間。
　　 2.化濁解毒調(diào)肝方對(duì)肝纖維化大鼠肝臟病理形態(tài)學(xué)的影響肉眼觀察，正常組大鼠肝臟質(zhì)地軟，顏色呈深紅色，表面光滑，邊緣銳圓。模型組大鼠肝臟明顯腫大，質(zhì)地較硬，顏色片偏暗紅，表面有結(jié)節(jié)形成而粗糙不平，有的可見(jiàn)顆粒樣凸起，邊

6、緣較純。秋水仙堿組和中藥治療各組大鼠肝臟肝臟腫大不明顯，表面比較光滑，偶見(jiàn)沙粒樣增生，顏色略見(jiàn)暗紅，質(zhì)地較脆。
　　 光鏡下觀察，正常組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞圍繞中央靜脈呈放射狀的排列，肝細(xì)胞核大而圓，無(wú)變性壞死，未見(jiàn)明顯的纖維結(jié)締組織增生。模型組可見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞，肝細(xì)胞廣泛的脂肪變性、壞死并伴炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維組織大量增生，個(gè)別動(dòng)物可見(jiàn)假小葉形成。中藥治療各組和西藥對(duì)照組肝組織病理的損傷程度與模型組相比均可見(jiàn)有不同程度

7、的修復(fù)，尤其是化濁解毒調(diào)肝方高劑量組，肝細(xì)胞脂肪變性及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較模型組減少，膠原纖維增生較輕，主要散在于肝血竇和disse 間隙、匯管區(qū)，無(wú)假小葉形成。
　　 3.化濁解毒調(diào)肝方對(duì)肝纖維化大鼠肝組織TβRIImRNA表達(dá)的影響與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組大鼠肝組織TβRIImRNA的表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.01)；
　　 化濁解毒調(diào)肝方高劑量組、低劑量組及秋水仙堿組與模型組相比TβRIImRNA的表達(dá)均有明顯下降(P<

8、0.01)；化濁解毒調(diào)肝方高劑量組與秋水仙堿組相比TβRIImRNA的表達(dá)有顯著性降低(P<0.01)；化濁解毒調(diào)肝方高劑量組與化濁解毒調(diào)肝方小劑量相比TβRIImRNA的表達(dá)有顯著性降低(P<0.01)；化濁解毒調(diào)肝方小劑量組與秋水仙堿組相比TβRIImRNA的表達(dá)無(wú)明顯差異（P>0.05）。
　　 4.化濁解毒調(diào)肝方對(duì)肝纖維化大鼠肝組織smad4蛋白表達(dá)的影響與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組大鼠肝組織smad4 蛋白的表達(dá)量明顯

9、增強(qiáng)；化濁解毒調(diào)肝方高劑量組、低劑量組及秋水仙堿組與模型組相比smad4 蛋白的表達(dá)量均有明顯下降(P<0.01)；化濁解毒調(diào)肝方高劑量組與秋水仙堿組相比smad4 蛋白的表達(dá)量有顯著性降低(P<0.01)；化濁解毒調(diào)肝方高劑量組與化濁解毒調(diào)肝方小劑量相比smad4 蛋白的表達(dá)量有顯著性降低(P<0.01)；化濁解毒調(diào)肝方小劑量組與秋水仙堿組相比smad4 蛋白的表達(dá)量無(wú)明顯差異（P>0.05）。
　　 結(jié)論：
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