葉酸對(duì)妊娠大鼠胎盤PCNA、P16、CyclinD1表達(dá)及胎盤功能的影響.pdf

1、目的:
　　葉酸臨床應(yīng)用于預(yù)防神經(jīng)管畸形等人類出生缺陷的效果已得到肯定。本實(shí)驗(yàn)通過給予妊娠大鼠灌服大、中、小劑量葉酸,采用HE染色方法觀察葉酸對(duì)胎盤形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響;免疫細(xì)胞化學(xué)方法分析葉酸對(duì)妊娠大鼠胎盤PCNA、P16、CyclinD1表達(dá)的作用;應(yīng)用固相酶聯(lián)免疫法(ELISA),檢測(cè)血清游離雌三醇(FE3)水平的變化,旨在探討葉酸對(duì)胎盤生長(zhǎng)發(fā)育及功能的影響,為臨床安全、合理應(yīng)用葉酸預(yù)防出生缺陷性疾病提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　

2、　方法:
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組及干預(yù):8～10周齡健康清潔級(jí)SD大鼠60只。雌性40只,雄性20只。雌性大鼠隨機(jī)分為四組:對(duì)照組、大、中、小劑量葉酸干預(yù)組,每組10只。大鼠按1:2雄、雌比例合籠,次晨查陰栓陽性者確定為受孕,記為E0.5d。葉酸干預(yù)組自確定受孕之日起,分別灌服0.5mg/kg/d(小劑量組)、1.0mg/kg/d(中劑量組)、2.0mg/kg/d(大劑量組)的葉酸,連續(xù)10天。對(duì)照組灌服等容量生理鹽水。
　

3、　2.取材及制片:各組孕鼠均于妊娠13.5天(E13.5d)水合氯醛麻醉取材,每只孕鼠隨機(jī)取一個(gè)胎盤置于Bouin液固定,常規(guī)脫水、包埋,連續(xù)切片,每隔10張取兩張裱片,待染。經(jīng)心腔所取血液置于離心管離心獲取血清。
　　3.一般組織學(xué)技術(shù):切片HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察葉酸干預(yù)組與對(duì)照組胎盤組織結(jié)構(gòu)及細(xì)胞形態(tài)的發(fā)育狀態(tài)及變化。
　　4.免疫組織化學(xué)技術(shù):采用免疫組化超敏二步法顯示葉酸干預(yù)組和對(duì)照組胎盤中PCNA、P16、Cy

4、clinD1陽性細(xì)胞,應(yīng)用Mivnt顯微圖像分析儀分析陽性面積占分析面積的比率,說明PCNA、P16及CyclinD1表達(dá)的情況。
　　5.固相酶聯(lián)免疫技術(shù)(ELISA):檢測(cè)葉酸干預(yù)組與對(duì)照組妊娠大鼠血清FE3水平及變化,說明胎盤的功能狀態(tài)。
　　6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用單因素方差分析和q檢驗(yàn)。
　　結(jié)果:
　　1.一般組織學(xué)結(jié)果
　　顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),對(duì)照組的胎盤組織學(xué)分帶出現(xiàn),從胎鼠面向母體面依次為迷路帶、

5、海綿帶和蛻膜帶。迷路帶絨毛明顯,絨毛外包繞2-3層滋養(yǎng)層細(xì)胞,中部可見吻合的絨毛血管。海綿帶細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞排列成條索狀并交織成網(wǎng),網(wǎng)眼內(nèi)充以糖原細(xì)胞群或母體血管。可見體積較大的滋養(yǎng)層巨細(xì)胞。蛻膜帶若干膠原纖維和成纖維樣細(xì)胞交錯(cuò)排列,結(jié)構(gòu)緊湊,蛻膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰,未見空泡現(xiàn)象。葉酸干預(yù)各組大鼠胎盤組織及細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)與對(duì)照組比較無明顯變化。
　　2.免疫組化結(jié)果
　　2.1.PCNA的表達(dá)
　　PCNA在各組胎盤細(xì)胞均可見表

6、達(dá)。陽性物質(zhì)呈棕色或黃色顆粒狀,局限分布于細(xì)胞核內(nèi)。單因素方差分析顯示,葉酸干預(yù)組胎盤細(xì)胞PCNA的陽性率明顯高于對(duì)照組(P<0.01),提示葉酸提高了PCNA的表達(dá),具有促進(jìn)胎盤細(xì)胞增殖的作用。不同劑量葉酸組間比較q檢驗(yàn)表明,大、中劑量葉酸組PCNA的表達(dá)均明顯高于小劑量葉酸組,差異顯著(P<0.05);中劑量葉酸組PCNA的表達(dá)高于大劑量葉酸組,但無明顯差異(P>0.05),說明葉酸劑量的不同影響了PCNA的表達(dá)陽性率,不同劑量葉酸

7、使PCNA表達(dá)量不同,對(duì)妊娠大鼠胎盤細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用有差異,在一定范圍內(nèi)其增殖程度與劑量有關(guān)。
　　2.2.P16表達(dá)
　　P16在各組胎盤細(xì)胞均可見表達(dá)。陽性物質(zhì)呈棕色或黃色顆粒狀,大部分位于細(xì)胞核內(nèi),少數(shù)可見胞漿和胞核同時(shí)有少量表達(dá)。單因素方差分析顯示,葉酸干預(yù)組胎盤細(xì)胞P16的陽性率明顯低于對(duì)照組(P<0.01),提示葉酸能降低P16的表達(dá),減弱其抑制細(xì)胞增殖的作用。不同劑量葉酸組間比較q檢驗(yàn)表明,大、中劑量葉酸組P

8、16表達(dá)均低于小劑量葉酸組,差異顯著(P<0.05);大劑量葉酸組P16表達(dá)低于中劑量葉酸組,但無明顯差異(P>0.05)。不同劑量葉酸組P16表達(dá)量的差別,提示劑量可影響葉酸調(diào)節(jié)胎盤細(xì)胞增殖的作用,在一定范圍內(nèi)其調(diào)節(jié)增殖程度與劑量有關(guān)。
　　2.3.CyclinD1表達(dá)
　　CyclinD1在各組胎盤細(xì)胞均可見表達(dá)。陽性物質(zhì)呈棕色或黃色顆粒狀,大部分位于細(xì)胞核內(nèi),少數(shù)同時(shí)見于胞漿和胞核。單因素方差分析顯示,葉酸干預(yù)組胎盤細(xì)

9、胞中CyclinD1的表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P<0.01),說明葉酸提高了CyclinD1的陽性表達(dá),提示葉酸具有促進(jìn)胎盤細(xì)胞增殖的作用。不同劑量葉酸組間比較q檢驗(yàn)表明,大、中劑量葉酸組CyclinD1表達(dá)均高于小劑量葉酸組,差異顯著(P<0.05);大劑量葉酸組CyclinD1的表達(dá)高于中劑量葉酸組,但無明顯差別(P>0.05)。說明葉酸劑量的不同影響了CyclinD1表達(dá)陽性率,反映劑量使葉酸對(duì)妊娠大鼠胎盤細(xì)胞促進(jìn)增殖作用不同,在一定

10、范圍內(nèi)其增殖效應(yīng)與劑量有關(guān)。
　　3.FE3水平檢測(cè)結(jié)果
　　FE3水平按對(duì)照組、小劑量葉酸組、中劑量葉酸組、大劑量葉酸干預(yù)組順序呈逐漸升高趨勢(shì)。單因素方差分析顯示,葉酸干預(yù)組孕鼠體內(nèi)FE3水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05),說明葉酸提高了FE3水平,具有促進(jìn)胎盤合成功能的作用。不同劑量葉酸組之間比較q檢驗(yàn)表明,大、中劑量葉酸組FE3水平均明顯高于小劑量葉酸組(P<0.05);大劑量葉酸組與中劑量葉酸組之間比較FE3水平無明

11、顯差別(P>0.05)。說明葉酸劑量的不同影響孕鼠體內(nèi)FE3水平,提示劑量可能影響葉酸促進(jìn)胎盤細(xì)胞合成功能的能力,不同劑量的葉酸對(duì)胎盤合成功能的影響不同,在一定范圍內(nèi)其促進(jìn)合成效應(yīng)與劑量有關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1.給予受孕大鼠大、中、小劑量葉酸時(shí),胎盤的正常組織結(jié)構(gòu)與細(xì)胞形態(tài)的生長(zhǎng)發(fā)育無明顯改變。
　　2.大、中、小劑量葉酸干預(yù)能提高胎盤細(xì)胞PCNA的表達(dá),葉酸具有促進(jìn)胎盤細(xì)胞增殖的作用。不同劑量的葉酸對(duì)胎盤細(xì)胞增殖影

12、響程度不同,一定范圍內(nèi)其促增殖效應(yīng)與劑量有關(guān)。
　　3.妊娠大鼠服用大、中、小劑量葉酸可降低胎盤細(xì)胞內(nèi)P16的表達(dá),使其抑制細(xì)胞增殖作用減弱。不同劑量葉酸影響P16抑制妊娠大鼠胎盤細(xì)胞增殖作用程度不同,在一定范圍內(nèi)與劑量有明顯關(guān)聯(lián)。
　　4.葉酸干預(yù)能明顯提高孕鼠血清FE3水平,葉酸具有促進(jìn)胎盤細(xì)胞合成功能的作用。不同劑量的葉酸對(duì)胎盤合成功能的影響不同,在一定范圍內(nèi)合成效應(yīng)與劑量有關(guān)。
　　5.綜上所述,葉酸可能通過影