胰島素抵抗大鼠胰島及HIT-T15細(xì)胞氧化應(yīng)激與自吞噬的研究.pdf

1、觀察高脂飼養(yǎng)大鼠胰島素抵抗時(shí)胰島β細(xì)胞是否發(fā)生自吞噬現(xiàn)象，并探討胰島氧化應(yīng)激與胰島β細(xì)胞自吞噬的關(guān)系。 材料與方法： 40只雄性Wistar大鼠，分為單純高脂和正常飼料組，每組又分為5個(gè)亞組，分別代表5個(gè)階段，大鼠喂養(yǎng)至10、14、16、18、20周時(shí)分階段處死。所有動(dòng)物處死前，禁食14小時(shí)，麻醉后尾靜脈取血測(cè)血糖，并心臟取血分別檢測(cè)血清或血漿中胰島素、甘油三酯、膽固醇、FFA等指標(biāo)，并迅速取出胰腺、肝臟、腎臟(肝臟、腎臟備第

2、二部分用)，取部分胰腺組織做冰凍切片及電鏡觀察，部分分離純化胰島，液氮凍存，待標(biāo)本收齊后，作組織勻漿，采用BCA蛋白定量法，測(cè)定組織中蛋白濃度，采用比色法測(cè)定胰島組織勻漿中SOD及MDA的含量。采用MDC(monodansylcadaverine)染色胰腺組織冰凍切片，并進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡熒光定量以及透射電鏡直接觀察自吞噬泡來(lái)觀察胰島自吞噬現(xiàn)象的發(fā)生。所有標(biāo)本結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。每一個(gè)亞組均與同期對(duì)照比較并進(jìn)行亞組間比較作統(tǒng)計(jì)分析

3、。 發(fā)現(xiàn)：1．高脂飼養(yǎng)大鼠在飼養(yǎng)10周以后體重明顯高于正常，腹型肥胖形成(VF／W值3.9±0.15 vs.2.4±0.1，p<0.05)，同時(shí)伴有高胰島素血癥(1.05±0.18 vs.0.52±0.02，p<0.05)、高甘油三酯(1.37±0.22 vs.0.66 ±0.05,p<0.05)、高膽固醇血癥(1.02±0.02 vs．0.78±0.05，p<0.05)、高游離脂肪酸血癥(451±20vs.408±13

4、，p<0.05)，胰島素敏感指數(shù)下降(0.38±0.02 vs.1.35±0.21，p<0.05)、HOMA-IR指數(shù)升高(0.33±0.05vs0.15±0.02，p<0.05)。2．在14周末時(shí)，胰島組織內(nèi)SOD活力下降，至20周末時(shí)，下降顯著(1.32±0.27 vs.9.47±0.86，p<0.01)，并隨著年齡增長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，同時(shí)，胰島組織內(nèi)MDA含量增高，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，呈增高趨勢(shì)，20周末時(shí)明顯增高(3.23±O.18 VS

5、.1.2±0.23，p<0.01)。3．電鏡觀察：16周末時(shí)，胰島β細(xì)胞內(nèi)有線粒體腫脹；18周末時(shí)，我們可看到β細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)固縮，線粒體腫脹樣變，胞漿內(nèi)見(jiàn)有少量圓形或橢圓形空泡樣改變,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)顆粒減少，輕度擴(kuò)張；20周末時(shí)，我們看到全視野下，胞漿內(nèi)分泌顆粒減少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，表面顆粒減少，胞漿內(nèi)有較為多量的圓形或橢圓形空泡，未見(jiàn)初級(jí)溶酶體或次級(jí)溶酶體改變。4．激光掃描共聚焦顯微鏡定量分析胰島內(nèi)MDC熒光強(qiáng)度，各個(gè)時(shí)段內(nèi)正常組與對(duì)照組

6、比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，各個(gè)時(shí)段縱向比較亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論和解釋 1.10周末時(shí)，高脂飼養(yǎng)大鼠已經(jīng)形成穩(wěn)定的胰島素抵抗模型。2．全身胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，隨時(shí)間推移，胰島組織內(nèi)氧化應(yīng)激增加。3．在20周內(nèi)，無(wú)確切的證據(jù)表明胰島B細(xì)胞發(fā)生了自吞噬現(xiàn)象。4．然而在20周末的胰島素抵抗大鼠胰島β細(xì)胞胞漿內(nèi)觀察到有多量的空泡樣結(jié)構(gòu)，其是否為前自吞噬體，需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。隨著胰島內(nèi)氧化應(yīng)激的加重，胰島β細(xì)胞內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，表面顆粒減少，

7、蛋白質(zhì)合成受損，發(fā)生了胰島β細(xì)胞功能障礙。 研究目的：觀察高糖高脂刺激β細(xì)胞株HIT-T15細(xì)胞時(shí)氧化應(yīng)激變化及細(xì)胞的自吞噬現(xiàn)象。 材料與方法：胰島β細(xì)胞株HIT-T15細(xì)胞按照干預(yù)因素及時(shí)間不同，分為以下六組：①正常培養(yǎng)24小時(shí)組(含5.5 mmol／1葡萄糖的1640培養(yǎng)液)②正常培養(yǎng)48小時(shí)組(含5.5 mmol／l葡萄糖的1640培養(yǎng)液)③0.5mmol／1 FFA、5/5 mmol／1葡萄糖培養(yǎng)24小時(shí)組④0.

8、5mmol／1 FFA、5.5mmol／1葡萄糖培養(yǎng)48小時(shí)組⑤含16.7 mmol／1葡萄糖1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)組⑥含16.7 mmol／1葡萄糖1640培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時(shí)組。各組細(xì)胞分別觀察以下指標(biāo)：1．放射免疫分析法檢測(cè)基礎(chǔ)胰島素及糖刺激胰島素分泌的變化。2．流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化。3．各組細(xì)胞MDC染色10分鐘后，熒光顯微鏡觀察、照片并激光掃描共聚焦顯微鏡定量分析MDC熒光強(qiáng)度。 結(jié)果與發(fā)現(xiàn)：1．16

9、.7 retool／1葡萄糖刺激HIT-TI5細(xì)胞24小時(shí)后，基礎(chǔ)胰島素分泌增加(40.9±10.6 vs 13.0±0.05)，糖刺激胰島素分泌(GSIS)減少(4.6±1.68 vs 12.5±0.03)；刺激48小時(shí)后，同樣基礎(chǔ)胰島素分泌增加(44.4±18.6 vs 14.8±0.12)，GSIS減少(3.6±0.9 vs 12.8±0.1)，但這兩組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2．0.5mmol／l FFA刺激HIT-T15細(xì)胞24小時(shí)

10、后，基礎(chǔ)胰島素分泌增加(40.9±12.4 vs 13.0±0.05)，GSIS減少(5.6±1.2 vs 12.5±0.03)，刺激48小時(shí)后，基礎(chǔ)胰島素分泌繼續(xù)增加(43.4±13.0 VS 14.8±0.12)，GSIS減少(3.2±1.3 vs 12.8±0.1)。3．16.7 mmol／1葡萄糖刺激HIT-T15細(xì)胞24及48小時(shí)后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平隨刺激時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增加(39.9±27.3[24h]／55.8±51.1[4

11、8h]vs 6.96±3.58)4.0.5 mmol／1FFA刺激HIT-T15細(xì)胞24、48小時(shí)后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平高于隨刺激時(shí)間延長(zhǎng)而增加(38.1±26.1[24h]／81.1±71.5[48h]vs 6.96±3.58[N])，且48小時(shí)末，高脂刺激組細(xì)胞內(nèi)ROS水平高于高糖組(81.1±71.5 vs 55.5±51.1)，這提示我們高糖高脂刺激可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平增加。5.16.7 mmol／1葡萄糖刺激HIT-T15

12、細(xì)胞24及48小時(shí)后，細(xì)胞內(nèi)MDC熒光強(qiáng)度增加(27.5±6.9[24h]／30.9±4.9[48]VS 20.4±4.0)，O.5 mmol／1FFA刺激HIT-T15細(xì)胞24及48小時(shí)后，細(xì)胞內(nèi)MDC熒光強(qiáng)度亦增加(30.4±3.4[24h]／26.9±5.1 [48h]VS 20.0±4.O)，但高糖高脂處理組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示高糖高脂處理后可出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)MDC標(biāo)記的結(jié)構(gòu)增加，即可能細(xì)胞內(nèi)自吞噬活性增加。 研究目的：胰

13、島素抵抗大鼠胰島、肝臟、腎臟氧化應(yīng)激的變化與二甲雙胍、羅格列酮干預(yù)后對(duì)其的影響材料與方法：76只雄性wistar大鼠，分為三部分： (A)：40只隨機(jī)分為兩大組，即高脂組和正常對(duì)照組，每個(gè)大組再分為5個(gè)亞組(10、14、16、18、20周)，每組4只動(dòng)物，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分階段處死動(dòng)物。(*注：同第一部分)(B)：18只Wistar大鼠，高脂飲食8周后，稱重，尾靜脈取血測(cè)定血糖、血脂、胰島素、FFA水平，計(jì)算ISI、HOMA-IR。然后隨

14、機(jī)分為三組，單純高脂組，高脂+二甲雙胍組，高脂+羅格列酮組，繼續(xù)飼養(yǎng)8周后處死動(dòng)物。 (C)：18只動(dòng)物，稱重并隨機(jī)分為三組，同B，高脂飼養(yǎng)同時(shí)即開(kāi)始灌胃二甲雙胍及羅格列酮，8周末處死動(dòng)物。二甲雙胍300mg／kg／d,羅格列酮4mg／kg／d進(jìn)行灌胃。所有動(dòng)物處死前，禁食14小時(shí)，麻醉后尾靜脈取血測(cè)血糖，并心臟取血分別檢測(cè)血清或血漿中胰島素、甘油三酯、膽固醇、FFA等指標(biāo)，并迅速取出胰腺、肝臟、腎臟凍存于液氮罐中。標(biāo)本收齊后，比色法

15、測(cè)定肝臟、腎臟組織勻漿中SOD及MDA含量。所有標(biāo)本結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)和方差分析。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)觀察了胰島素抵抗時(shí)胰島、肝臟、腎臟氧化應(yīng)激的變化和二甲雙胍、羅格列酮干預(yù)后對(duì)氧化應(yīng)激的影響。結(jié)果有以下發(fā)現(xiàn)：1．胰島素抵抗大鼠在尚未出現(xiàn)明顯糖代謝紊亂的情況下，胰島、肝臟、腎臟組織中就已經(jīng)發(fā)生了氧化應(yīng)激 2 二甲雙胍與羅格列酮能夠改善胰島、肝臟、腎臟的氧化應(yīng)激，尚未形成胰島素抵抗時(shí)，可保護(hù)機(jī)體抗氧化防護(hù)系統(tǒng)。一