水蛭素的舒血管作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:大電導(dǎo)鈣激活鉀通道（large-conductance calcium-activated potassiumchannels，BKCa）是廣泛分布在血管平滑肌的細(xì)胞(VSMCs)上的一種鉀通道，其具有電導(dǎo)值大、對(duì)鈣離子敏感、電壓依賴性等特性，通道通過(guò)負(fù)反饋機(jī)制來(lái)控制平滑肌細(xì)胞肌源性張力和靜息膜電位去極化程度，而B(niǎo)KCa通道的高電導(dǎo)性及在平滑肌細(xì)胞上的高密度表達(dá)決定了它對(duì)血管張力的調(diào)節(jié)。通過(guò)脂質(zhì)體Lipofectamine2000

2、轉(zhuǎn)染法在HEK293上轉(zhuǎn)染BKCaα亞單位，用濃度為0.8 mg/L G418篩選，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)的單克隆細(xì)胞系，在該表達(dá)細(xì)胞上可以記錄到與天然細(xì)胞上電生理特性相似的BKCa電流。由此我們建立了BKCaα單克隆HEK293細(xì)胞模型，并在其上研究藥物對(duì)該通道的作用機(jī)制。水蛭素(Hirudin，HIR)在中醫(yī)上被認(rèn)為有著逐瘀、通經(jīng)、活血、破血功效，它是由醫(yī)用水蛭唾液腺提取出的多種活性多肽組成，是一種絲氨酸蛋白酶，具有阻止血小板聚集，抗血栓形成

3、的作用。臨床上主要用于治療腦中風(fēng)，腫瘤等疾病，但活血作用在組織細(xì)胞和離子通道上鮮有報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察HIR對(duì)大鼠腸系膜血管動(dòng)脈張力的作用及對(duì)HEK293上轉(zhuǎn)染的BKCa通道作用研究，探討其對(duì)血管作用及機(jī)制，為HIR應(yīng)用于臨床提供更多實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:(1)大鼠血管環(huán)實(shí)驗(yàn):用3％戊巴比妥鈉麻醉大鼠，開(kāi)腹取出腸系膜，分離出單根的腸系膜動(dòng)脈，用眼科剪輕輕剔除血管上的脂肪和結(jié)締組織，并將動(dòng)脈血管剪成2-3 mm的血管環(huán)，迅速放入含鈣

4、的溶液Ⅰ中，用兩根銀絲穿過(guò)剪好的小動(dòng)脈環(huán)，確保兩根銀絲平行并固定在DMT的換能器上，將掛好的血管與張力換能器、生物放大器與生理記錄儀連接，采用Chart7軟件采集數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析，觀察腸系膜血管的活性，并觀察HIR對(duì)血管張力的影響以及其作用機(jī)制。(2)單通道膜片鉗實(shí)驗(yàn):通過(guò)脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染BKCa表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-BKα，用0.8 mg/mlG418篩選出穩(wěn)定表達(dá)的單克隆細(xì)胞系進(jìn)行膜片鉗實(shí)驗(yàn)。其電

5、流信號(hào)通過(guò)膜片放大器放大，1KHz低通進(jìn)行濾波，再經(jīng)12位A/D、D/A轉(zhuǎn)換器輸入電腦，用pClamp軟件記錄電流，并觀察BKCa電流特征，以及HIR對(duì)BKCa電流的作用。
　　結(jié)果:1.HIR對(duì)大鼠腸系膜動(dòng)脈血管環(huán)的作用:(1)用60 mM KCl5min進(jìn)行預(yù)收縮兩次，將引起收縮差異小于20％的血管用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。(2)用0.8μM NE去誘導(dǎo)血管收縮2min左右，加入25mg/L HIR可以使血管環(huán)舒張78.8±1.06％(n

6、=5，P＜0.05)。(3)在0.8μM NE引起血管環(huán)預(yù)收縮，再此基礎(chǔ)上加入25mg/L HIR，在舒張明顯時(shí)加入5 mMBKCa非特異性阻斷劑TEA，觀察到TEA對(duì)血管有收縮作用，說(shuō)明HIR對(duì)大鼠腸系膜血管的舒張作用有K+通道參與。(4)當(dāng)0.8μM NE引起血管預(yù)收縮后，加入不同濃度的HIR，觀察血管環(huán)的舒縮變化，舒張明顯時(shí)，再加入200 nM BKCa通道特異性阻斷劑IbTX，可引起血管收縮，其收縮百分比為7.96±1.06％，

7、(n=3，P＜0.05)，說(shuō)明HIR對(duì)大鼠腸系膜血管的舒張作用有BKCa通道的參與。2.HIR對(duì)HEK293細(xì)胞上轉(zhuǎn)染的BKCaα通道電流的作用:(1)HEK293細(xì)胞上轉(zhuǎn)染的BKCaα通道的基本特征:(a) BKCaα通道的電導(dǎo)值:通過(guò)inside-out膜片鉗記錄，在140mM[K+]0/140mM[K+]i記錄條件下HEK293細(xì)胞上轉(zhuǎn)染的BKα通道的電導(dǎo)值為236.73±3.27pS(n=5)。(b)在對(duì)稱性高鉀溶液時(shí)，觀察Ⅰ-

8、Ⅴ曲線，曲線通過(guò)0點(diǎn)反轉(zhuǎn)電位為0 mV。(c)BKCaα通道的電壓依賴性:在inside-out膜片鉗記錄下，膜電位從+10 mV增加到+60 mV時(shí)，隨著膜電位的增加，該通道的電流也逐漸增大。(d) BKCaα通道的鈣離子敏感性:在inside-out膜片鉗記錄下，隨著鈣離子濃度增加(0nM和111 nM Ca2+)，該電流明顯增大。(e)在outside-out膜片下，200 nM IbTX幾乎可以完全阻斷該通道。(2)HIR對(duì)HE

9、K293細(xì)胞上轉(zhuǎn)染的BKCaα通道電流的作用:HIR對(duì)BKCaα通道的藥物依賴性，在inside-out膜片鉗記錄下，膜電位為+50mV時(shí)，隨著HIR濃度的增加， BKCaα通道電流也隨之逐漸增大。當(dāng)HIR濃度從0mg/L分別增加到25、50、100、200 mg/L時(shí)，BKCaα通道的開(kāi)放概率分別從0.00683±0.0049增加到0.0159±0.0014(n=5，P=0.038＜0.05)、0.0228±0.0016(n=5,P=

10、0.0061＜0.05)、0.0469±0.0073(n=5,P=0.0276＜0.05)、0.0856±0.0103（n=5，P=0.00029＜0.01），說(shuō)明HIR對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系BKCaα通道電流的激活作用具有濃度依賴性。在此基礎(chǔ)上加入20 mM EGTA（鈣離子螯合劑），該通道概率降低到0.0599±0.0070（n=5，P=0.0004＜0.01），HIR激活BKCa僅通道電流的作用仍存在。說(shuō)明HIR對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系BKCa

11、α通道電流的激活作用不依賴于鈣離子。BKCaα通道電流的幅度值(Amplitude，Amp)隨著藥物濃度的增加無(wú)明顯變化;BKCaα通道的平均開(kāi)放時(shí)間(OpenTime，To)隨著藥物濃度的增加有所增加，在200 mg/LHIR時(shí)，與對(duì)照組相比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;BKCaα通道的平均關(guān)閉時(shí)間(Close Time，TC)隨著藥物濃度的增加有所降低，各組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論:1.HIR具有血管舒張。2.HIR的舒血管作用與HIR