血管生成素2在口腔鱗癌形成中的作用及有關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、實(shí)體瘤的生長依賴腫瘤血管,從周圍已存在的血管中經(jīng)過芽生形成新的血管謂之血管生成.血管生成素(Angiopoietins,Angs)是近年來發(fā)現(xiàn)的繼內(nèi)皮細(xì)胞生長因子和酪氨酸激酶受體(VEGF/KDR)之后的另一類與血管生成密切相關(guān)的一大家族,不僅在胚胎血管發(fā)育和多種生理狀態(tài)下的血管生成中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,還與腫瘤、炎癥、創(chuàng)傷等病理狀態(tài)下的血管生成密切相關(guān),但其效應(yīng)和作用機(jī)制尚在不斷的探索之中.本課題將檢測Ang-2在口腔頜面部鱗癌組織中的表達(dá)

2、,分析其表達(dá)強(qiáng)度與臨床生物學(xué)行為的關(guān)系,并建立Ang-2轉(zhuǎn)基因的Tca8113舌鱗癌裸鼠移植瘤模型,以進(jìn)一步探討Ang-2在口腔鱗癌生長中的作用,及其與VEGF、基質(zhì)金屬蛋白酶、一氧化氮等其它促血管生長因子之間的關(guān)系. 第一部分血管生成素2在口腔頜面部鱗癌中的表達(dá)及意義 一、研究目的 檢測Ang-2在口腔頜面部鱗癌中的表達(dá),并分析其表達(dá)強(qiáng)度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期等臨床生物學(xué)行為的關(guān)系,以初步了解Ang-2在口腔

3、頜面部惡性腫瘤生長中的作用. 二、材料方法 1.組織標(biāo)本 選取2003.5--2006.5浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院口腔外科手術(shù)切除的口腔頜面部鱗癌組織及癌旁無瘤組織. 2.方法：(1) 實(shí)時(shí)熒光定量法檢測Ang-2 mRNA,VEGF mRNA在口腔頜面部鱗癌中的表達(dá).(2) 免疫組化半定量法檢測Ang-2、VEGF蛋白在口腔頜面部鱗癌中的表達(dá). 三、結(jié)果 1.Ang-2 mRNA、VE

4、GF mRNA在口腔頜面部鱗癌中的表達(dá) Ang-2 mRNA,VEGF mRNA在癌組織中的表達(dá)為6.86±1.37、9.36±2.75,在癌旁無瘤組織中的表達(dá)為7.95±2.08、11.03±2.67,差異有顯著意義(P<0.05). 2.Ang-2、VEGF 蛋白在口腔頜面部鱗癌中的表達(dá)Ang-2、VEGF陽性染色定位于腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿和胞膜中,腫瘤組織中的Ang-2、VEGF蛋白合成明顯活躍,半定量計(jì)

5、分法提示Ang-2、VEGF蛋白在腫瘤組織中的陽性表達(dá)率為53.57﹪、60.71﹪;在癌旁無瘤組織中的陽性表達(dá)率為 24.00﹪、28.00﹪,差異有顯著意義(P<0.05)3.Ang-2表達(dá)強(qiáng)度與口腔頜面部鱗癌臨床生物學(xué)行為的關(guān)系 Ang-2 mRNA在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性和陽性組的表達(dá)分別為7.07±1.50、6.60±1.21;在Ⅰ、Ⅱ與Ⅲ、Ⅳ的不同臨床分期組的表達(dá)分別為7.17±1.58、6.59±1.14,差異均無顯著意義(P>0

6、.05). 四、結(jié)論 1. Ang-2 mRNA、VEGF mRNA在口腔頜面部鱗癌中的表達(dá)高于癌旁無瘤組織. 2. Ang-2、VEGF蛋白在口腔頜面部鱗癌中的表達(dá)高于癌旁無瘤組織,兩者不僅定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞,也定位于腫瘤細(xì)胞的胞漿和胞膜中,提示共同參與了口腔頜面部腫瘤血管的形成. 3. Ang-2的表達(dá)強(qiáng)度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期無明顯相關(guān)性,這一點(diǎn)需要更人的樣本量進(jìn)一步研證. 第二部分血管生成

7、素2對(duì)舌鱗癌裸鼠移植瘤的成瘤影響 一、研究目的 為進(jìn)一步探討Ang-2在口腔頜面部腫瘤中的成瘤效應(yīng),本實(shí)驗(yàn)旨在構(gòu)建.Ang-2轉(zhuǎn)基因的Tca8113舌鱗癌細(xì)胞系,觀察Ang-2對(duì)舌鱗癌裸鼠體內(nèi)成瘤的影響. 二、研究方法 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞和主要試劑：(1) 裸鼠:6周齡健康雌性BALB/C裸鼠27只,分三組.(2) 細(xì)胞株:人舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Tca8113,購自上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院口腔生物研

8、究所.(3) 克隆質(zhì)粒pBLAST49-hANGFT-2:購于Invivogen公司. 2.方法：(1) 構(gòu)建pcDNA3.1(-)B/Ang-2重組表達(dá)質(zhì)粒.(2) 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法:pcDNA3.1(-)B/Ang-2導(dǎo)入Tea8113細(xì)胞系,G418篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)Ang-2基因的Tca8113細(xì)胞,并以RT-PCR.及qRT-PCR法檢測Tca8113/Ang-2、Tca8113/pcDNA3.1(-)B、Tea8113三組細(xì)胞中A

9、ng-2基因的不同表達(dá).(3) 裸鼠移植瘤建立:3×10<'6>個(gè)腫瘤細(xì)胞接種于裸鼠背部皮下,觀察移植瘤的成瘤時(shí)間及生長.(4) 免疫組織化學(xué)法:檢測各組腫瘤組織內(nèi)Ang-2蛋白的表達(dá). 三、結(jié)果 1.pcDNA3-1(-)B/Ang-2重組表達(dá)質(zhì)粒的成功構(gòu)建Ang-2全長cDNA純化產(chǎn)物在T4連接酶的作剛下與pcDNA3.1(-)B載體進(jìn)行體外基因重組,構(gòu)建pcDNA3.1(-)B/Ang-2重組表達(dá)質(zhì)粒.經(jīng)酶切法及核

10、酸雙向測序法鑒定其內(nèi)含hang-2基因. 2.穩(wěn)轉(zhuǎn)Ang-2基因的Tca8113細(xì)胞系的成功建立pcDNA3.1(-)B/Ang-2及pcDNA3.1(-)B通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)入Tea8113細(xì)胞系,RT-PCR結(jié)果證明只有Tea8113/Ang-2細(xì)胞顯示Ang-2陽性條帶,qRT-PCR分析進(jìn)一步檢測到Tca8113/Ang-2細(xì)胞中Ang-2 mRNA的表達(dá)量是內(nèi)源Ang-2 mRNA表達(dá)的7690倍. 3.An

11、g-2轉(zhuǎn)基因的Tca8113細(xì)胞裸鼠移植瘤的成功建立 免疫組化結(jié)果顯示:在Tca8113/Ang-2組,大量Ang-2陽性染色定位于腫瘤細(xì)胞的胞漿和胞膜中,而在Tea8113/pcDNA3.1(-)B、Tea8113組只有少量散在、稀疏的淡黃色染色,進(jìn)一步從蛋白質(zhì)水平證實(shí)了Ang-2轉(zhuǎn)基因的舌鱗癌裸鼠移植瘤的成功建立.4.轉(zhuǎn)基因表達(dá)的Ang-2對(duì)舌鱗癌移植瘤成瘤時(shí)間的影響Tea8113/Ang-2、Tea8113/pcDNA3.

12、1(-)B、Tea8113組的平均成瘤時(shí)間分別為13.0、4.7和5.1天,可見Ang-2轉(zhuǎn)基因組成瘤時(shí)間長于對(duì)照組(P<0.05).5.轉(zhuǎn)基因表達(dá)的Ang-2對(duì)舌鱗癌細(xì)胞裸鼠移植瘤生長的影響Tea8113/Ang-2組腫瘤生長速度較Tca8113/pcDNA3.1(-)B、Tea8113組明顯滯后(P<0.05).5周后平均瘤重分別為0.531±0.398g、1.427±0.903g、1.5524±0.663g,Tca8113//An

13、g-2組瘤重較未轉(zhuǎn)染組明顯降低,差異有顯著意義(P<0.05). 四、結(jié)論 1.成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(-)B/Ang-2,及Ang-2穩(wěn)轉(zhuǎn)的舌鱗癌細(xì)胞系Tea8113/Ang-2,在此基礎(chǔ)上建立的Ang-2轉(zhuǎn)基因的舌鱗癌Tca8113裸鼠移植瘤可作為研究Ang-2在口腔腫瘤中作用的理想動(dòng)物模型. 2.轉(zhuǎn)基因表達(dá)的Ang-2延長了舌鱗癌Tea8113裸鼠移植瘤的成瘤時(shí)間. 3.轉(zhuǎn)基因表達(dá)的