血管生成素2在口腔鱗癌形成中的作用及有關機制研究.pdf

1、實體瘤的生長依賴腫瘤血管,從周圍已存在的血管中經過芽生形成新的血管謂之血管生成.血管生成素(Angiopoietins,Angs)是近年來發(fā)現的繼內皮細胞生長因子和酪氨酸激酶受體(VEGF/KDR)之后的另一類與血管生成密切相關的一大家族,不僅在胚胎血管發(fā)育和多種生理狀態(tài)下的血管生成中發(fā)揮調節(jié)作用,還與腫瘤、炎癥、創(chuàng)傷等病理狀態(tài)下的血管生成密切相關,但其效應和作用機制尚在不斷的探索之中.本課題將檢測Ang-2在口腔頜面部鱗癌組織中的表達

2、,分析其表達強度與臨床生物學行為的關系,并建立Ang-2轉基因的Tca8113舌鱗癌裸鼠移植瘤模型,以進一步探討Ang-2在口腔鱗癌生長中的作用,及其與VEGF、基質金屬蛋白酶、一氧化氮等其它促血管生長因子之間的關系. 第一部分血管生成素2在口腔頜面部鱗癌中的表達及意義 一、研究目的 檢測Ang-2在口腔頜面部鱗癌中的表達,并分析其表達強度與淋巴結轉移、腫瘤分期等臨床生物學行為的關系,以初步了解Ang-2在口腔

3、頜面部惡性腫瘤生長中的作用. 二、材料方法 1.組織標本 選取2003.5--2006.5浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院口腔外科手術切除的口腔頜面部鱗癌組織及癌旁無瘤組織. 2.方法：(1) 實時熒光定量法檢測Ang-2 mRNA,VEGF mRNA在口腔頜面部鱗癌中的表達.(2) 免疫組化半定量法檢測Ang-2、VEGF蛋白在口腔頜面部鱗癌中的表達. 三、結果 1.Ang-2 mRNA、VE

4、GF mRNA在口腔頜面部鱗癌中的表達 Ang-2 mRNA,VEGF mRNA在癌組織中的表達為6.86±1.37、9.36±2.75,在癌旁無瘤組織中的表達為7.95±2.08、11.03±2.67,差異有顯著意義(P<0.05). 2.Ang-2、VEGF 蛋白在口腔頜面部鱗癌中的表達Ang-2、VEGF陽性染色定位于腫瘤細胞和血管內皮細胞的胞漿和胞膜中,腫瘤組織中的Ang-2、VEGF蛋白合成明顯活躍,半定量計

5、分法提示Ang-2、VEGF蛋白在腫瘤組織中的陽性表達率為53.57﹪、60.71﹪;在癌旁無瘤組織中的陽性表達率為 24.00﹪、28.00﹪,差異有顯著意義(P<0.05)3.Ang-2表達強度與口腔頜面部鱗癌臨床生物學行為的關系 Ang-2 mRNA在淋巴結轉移陰性和陽性組的表達分別為7.07±1.50、6.60±1.21;在Ⅰ、Ⅱ與Ⅲ、Ⅳ的不同臨床分期組的表達分別為7.17±1.58、6.59±1.14,差異均無顯著意義(P>0

6、.05). 四、結論 1. Ang-2 mRNA、VEGF mRNA在口腔頜面部鱗癌中的表達高于癌旁無瘤組織. 2. Ang-2、VEGF蛋白在口腔頜面部鱗癌中的表達高于癌旁無瘤組織,兩者不僅定位于血管內皮細胞,也定位于腫瘤細胞的胞漿和胞膜中,提示共同參與了口腔頜面部腫瘤血管的形成. 3. Ang-2的表達強度與淋巴結轉移及臨床分期無明顯相關性,這一點需要更人的樣本量進一步研證. 第二部分血管生成

7、素2對舌鱗癌裸鼠移植瘤的成瘤影響 一、研究目的 為進一步探討Ang-2在口腔頜面部腫瘤中的成瘤效應,本實驗旨在構建.Ang-2轉基因的Tca8113舌鱗癌細胞系,觀察Ang-2對舌鱗癌裸鼠體內成瘤的影響. 二、研究方法 1.實驗動物、細胞和主要試劑：(1) 裸鼠:6周齡健康雌性BALB/C裸鼠27只,分三組.(2) 細胞株:人舌鱗狀細胞癌細胞系Tca8113,購自上海第二醫(yī)科大學附屬第九人民醫(yī)院口腔生物研

8、究所.(3) 克隆質粒pBLAST49-hANGFT-2:購于Invivogen公司. 2.方法：(1) 構建pcDNA3.1(-)B/Ang-2重組表達質粒.(2) 脂質體轉染法:pcDNA3.1(-)B/Ang-2導入Tea8113細胞系,G418篩選穩(wěn)轉Ang-2基因的Tca8113細胞,并以RT-PCR.及qRT-PCR法檢測Tca8113/Ang-2、Tca8113/pcDNA3.1(-)B、Tea8113三組細胞中A

9、ng-2基因的不同表達.(3) 裸鼠移植瘤建立:3×10<'6>個腫瘤細胞接種于裸鼠背部皮下,觀察移植瘤的成瘤時間及生長.(4) 免疫組織化學法:檢測各組腫瘤組織內Ang-2蛋白的表達. 三、結果 1.pcDNA3-1(-)B/Ang-2重組表達質粒的成功構建Ang-2全長cDNA純化產物在T4連接酶的作剛下與pcDNA3.1(-)B載體進行體外基因重組,構建pcDNA3.1(-)B/Ang-2重組表達質粒.經酶切法及核

10、酸雙向測序法鑒定其內含hang-2基因. 2.穩(wěn)轉Ang-2基因的Tca8113細胞系的成功建立pcDNA3.1(-)B/Ang-2及pcDNA3.1(-)B通過脂質體轉染法轉入Tea8113細胞系,RT-PCR結果證明只有Tea8113/Ang-2細胞顯示Ang-2陽性條帶,qRT-PCR分析進一步檢測到Tca8113/Ang-2細胞中Ang-2 mRNA的表達量是內源Ang-2 mRNA表達的7690倍. 3.An

11、g-2轉基因的Tca8113細胞裸鼠移植瘤的成功建立 免疫組化結果顯示:在Tca8113/Ang-2組,大量Ang-2陽性染色定位于腫瘤細胞的胞漿和胞膜中,而在Tea8113/pcDNA3.1(-)B、Tea8113組只有少量散在、稀疏的淡黃色染色,進一步從蛋白質水平證實了Ang-2轉基因的舌鱗癌裸鼠移植瘤的成功建立.4.轉基因表達的Ang-2對舌鱗癌移植瘤成瘤時間的影響Tea8113/Ang-2、Tea8113/pcDNA3.

12、1(-)B、Tea8113組的平均成瘤時間分別為13.0、4.7和5.1天,可見Ang-2轉基因組成瘤時間長于對照組(P<0.05).5.轉基因表達的Ang-2對舌鱗癌細胞裸鼠移植瘤生長的影響Tea8113/Ang-2組腫瘤生長速度較Tca8113/pcDNA3.1(-)B、Tea8113組明顯滯后(P<0.05).5周后平均瘤重分別為0.531±0.398g、1.427±0.903g、1.5524±0.663g,Tca8113//An

13、g-2組瘤重較未轉染組明顯降低,差異有顯著意義(P<0.05). 四、結論 1.成功構建了真核表達質粒pcDNA3.1(-)B/Ang-2,及Ang-2穩(wěn)轉的舌鱗癌細胞系Tea8113/Ang-2,在此基礎上建立的Ang-2轉基因的舌鱗癌Tca8113裸鼠移植瘤可作為研究Ang-2在口腔腫瘤中作用的理想動物模型. 2.轉基因表達的Ang-2延長了舌鱗癌Tea8113裸鼠移植瘤的成瘤時間. 3.轉基因表達的