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文檔簡介
1、背景和目的:
前列腺癌(PCa)和前列腺增生(BPH)是泌尿外科常見的老年男性疾病,我國13.6%的老年男性患前列腺增生癥;在西方國家,前列腺癌死亡人數(shù)僅次于第一位的肺癌。當(dāng)前臨床診斷中主要使用前列腺特異抗原(PSA)作為前列腺癌和前列腺增生的主要鑒別診斷手段,用Gleason評分來進(jìn)行前列腺癌病理分級,用腫瘤惡性程度進(jìn)行前列腺癌細(xì)胞惡性分級,用TNM分期進(jìn)行前列腺癌臨床分期。然而由于PSA并非前列腺癌細(xì)胞所特有,前列腺增
2、生、前列腺炎,甚至乳腺癌等多種疾病亦會引起血漿中PSA升高。當(dāng)PSA在4~10 ng/ml時(shí),難以區(qū)分PCa和BPH。而進(jìn)行Gleason評分時(shí)以及腫瘤細(xì)胞的惡性程度受到病理醫(yī)生的主觀看法和經(jīng)驗(yàn)的影響,也不可能對前列腺癌的惡性程度進(jìn)行客觀,準(zhǔn)確的判定。因此臨床有必要尋找比PSA更可靠的診斷指標(biāo),比Gleason評分及腫瘤惡性程度分級更客觀的病理分級指標(biāo)。
近年來,SOX家族日益被人們所重視。其中的SOX9基因在前列腺組織中
3、特異性表達(dá)。雄激素通過激活雄激素受體(AR),一方面引發(fā)級聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致前列腺癌的形成。另一方面,SOX9基因可以促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞株中腫瘤細(xì)胞的變異和分化,激活基因表達(dá)SOX9分子,使SOX9表達(dá)量也在前列腺癌組織中上調(diào)表達(dá)。提示檢測前列腺組織中SOX9基因的表達(dá)值可以有助于前列腺癌的早期診斷和惡性程度的評估。
NM23基因是一種腫瘤定位的基因,該基因在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中起著負(fù)性調(diào)控作用。它通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的增生、分化、凋亡以及與
4、細(xì)胞間的相互作用在許多生理和病理過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(fluorescence quantitative realtime polymerase chainreaction,F(xiàn)Q-RT-PCR),是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)或染料,利用熒光信號的變化實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR反應(yīng)過程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。定量原理是PCR反應(yīng)時(shí)發(fā)射的熒光信號達(dá)到檢測域值時(shí)的循環(huán)數(shù)(Cycle
5、 threshold,Ct),即Ct值與模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系。起始拷貝數(shù)越多,Ct值越小。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR在反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng),反應(yīng)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)曲線對照,可獲得樣品的起始模板量。
本論文利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對良性前列腺增生和前列腺癌的組織中SOX9和NM23基因表達(dá)量進(jìn)行定量檢測。結(jié)合臨床中良性前列腺增生的病理診斷和前列腺癌的Gleason評分,腫瘤惡性程度分級以及前列腺癌的臨床
6、分期,探討SOX9和NM23基因在前列腺癌的診斷和病理分級中的意義,對腫瘤的無進(jìn)展生存期的指導(dǎo)作用,進(jìn)一步認(rèn)識SOX9和NM23基因的生物行為學(xué)特征。并探討其數(shù)值對前列腺癌各項(xiàng)指標(biāo)的臨床指導(dǎo)意義。
材料和方法:
收集廣州市第一人民醫(yī)院和廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院泌尿外科2009年12月至2012年12月收治的100例前列腺癌病人和80前列腺良性增生病人的臨床開放手術(shù),TURP(經(jīng)尿道前列腺切除術(shù))切下的組織、穿刺
7、活檢組織。正常前列腺組織由行膀胱癌根治術(shù)后標(biāo)本獲得。取得樣本后,馬上放入液氮瓶中速凍收集保存。其中PCa患者平均年齡73.5歲;BPH患者平均年齡68.3歲;正常前列腺3例,平均年齡58歲。并記錄石蠟切片觀測樣本的病理惡性程度分級,Gleason評分,記錄病例的臨床分期和腫瘤的無進(jìn)展生存期。患者的隨訪終點(diǎn)為:PSA連續(xù)兩次隨訪再次升高,以第一次升高的時(shí)間為隨訪終點(diǎn);或者核素骨掃描提示骨轉(zhuǎn)移;或者經(jīng)直腸超聲、CT、MR等影像學(xué)檢查提示前列
8、腺癌局部進(jìn)展或死亡。隨訪最后截止日期:2012年12月31日。
運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定標(biāo)本中SOX9和NM23基因的表達(dá)量比較良性前列腺增生和前列腺癌SOX9和NM23基因表達(dá)值:(1)以臨床樣本提取組織樣本。(2)應(yīng)用Takara Taq HS試劑。(3)使用儀器為熒光定量PCR儀RotorGene2000(Corbett公司),熒光定量PCR分析軟件用Rotor-gene v5。(4)提取mRNA。(5)從NCBI
9、的gene bank中檢索SOX9和NM23及β-actin基因的uniGene資料,從中獲得各基因的Normal mRNA序列及相關(guān)uniSTS。用VectorNT6.0軟件(Informax)定位相關(guān)uniSTS擴(kuò)增片段在Normal mRNA中的位置,選擇長度在100~300 bp,且位置近mRNA3'端的uniSTS序列。最后再經(jīng)NCBI網(wǎng)站的Blast軟件分析和e-PCR軟件確認(rèn)該片段的特異性,剔除特異性較差和e-PCR結(jié)果中
10、有重復(fù)的uniSTS引物。根據(jù)TMPRSS2和KLK11基因的mRNA序列及相關(guān)UniSTS序列,并考慮雜交和反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記的要求,以及ePCR結(jié)果,分析篩選到具有較好的特異性的序列。制作相應(yīng)的SOX9和NM23探針序列和其相應(yīng)的UniSTS引物序列。(6)對RNA樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。(7)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。(8)運(yùn)用相對定量方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:
良性前列腺增生癥和前列腺癌的SOX9和NM23
11、mRNA表達(dá)量(Ct值)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。將腫瘤惡性程度分為G1-G2以及G3兩組,Gleason評分分為大于6以及小于等于6組,臨床病理分期分為Ⅰ-Ⅱ組以及Ⅲ-Ⅳ組。對其腫瘤組織中的SOX9和NM23 mRNA表達(dá)量(Ct值)進(jìn)行獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。對腫瘤惡性程度(G1-G2和G3),Gleason評分(小于等于6和大于等于6),腫瘤的臨床分期(Ⅰ-Ⅱ和Ⅲ-Ⅳ)分組不同的無進(jìn)展生存期差異,進(jìn)行l(wèi)og-rank檢驗(yàn),并分別采用Kapla
12、n-Meier方法繪制生存曲線;多因素分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行分析。將單因素分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的臨床病理因素: Gleason評分、臨床分期、SOX9/NM23Ct值納入Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行綜合分析,變量篩選采用逐步向前回歸法,以P≤0.05為納入標(biāo)準(zhǔn),P≥0.10為剔除標(biāo)準(zhǔn)。
結(jié)果:
1、對良性前列腺增生癥和前列腺癌的SOX9和NM23 mRNA表達(dá)量(Ct值)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),發(fā)現(xiàn)SOX
13、9和NM23 mRNA表達(dá)量在良性前列腺增生癥和前列腺癌中的表達(dá)量有顯著性差異(P<0.05),SOX9和NM23 mRNA表達(dá)量在前列腺癌組織中比良性前列腺增生癥組織中要高。
2、對SOX9和NM23 mRNA表達(dá)量(Ct值)在前列腺癌中不同的病理因素進(jìn)行獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)在臨床分期,Gleason評分,腫瘤惡性程度的不同分組中SOX9和NM231 mRNA表達(dá)量(Ct值)均有顯著性差異(P<0.05)。SOX9mR
14、NA表達(dá)量(Ct值)隨臨床分期,Gleason評分,腫瘤惡性程度升高而升高。NM23mRNA表達(dá)量(Ct值)隨隨臨床分期,Gleason評分,腫瘤惡性程度升高而降低。
3、對各臨床病理因素分組不同的無進(jìn)展生存期差異,進(jìn)行l(wèi)og-rank檢驗(yàn),發(fā)現(xiàn)腫瘤惡性程度、Gleason評分、臨床分期、SOX9/NM23 Ct值在單因素分析中是前列腺癌無進(jìn)展生存期的影響因素。然后分別對Gleason評分、臨床分期、腫瘤惡性程度和SOX9
15、/NM23Ct值的不同分組繪制無進(jìn)展生存曲線。在所有病例中,Gleason評分≤6分的病例無進(jìn)展生存期長于Gleason評分>6分的病例(P<0.01,log-rank檢驗(yàn))。同樣地,臨床分期為Ⅰ-Ⅱ的比Ⅲ-Ⅳ的病例無進(jìn)展生存期長(P<0.01,log-rank檢驗(yàn)),腫瘤惡性程度分級為G1-G2的比G3的病例無進(jìn)展生存期長(P<0.01,log-rank檢驗(yàn))。SOX9/NM23 Ct小于2的比SOX9/NM23 Ct值大于等于2分組
16、的無進(jìn)展生存期差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,log-rank)。
4、將單因素分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的三項(xiàng)臨床病理因素:Gleason評分、臨床分期、SOX9/NM23 Ct值納入Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行綜合分析,變量篩選采用逐步向前回歸法,以P≤0.05為納入標(biāo)準(zhǔn),P≥0.10為剔除標(biāo)準(zhǔn)。最終確定Gleason評分(P<0.01)和SOX9/NM23 Ct值(P<0.01)是影響前列腺癌無進(jìn)展生存期的主要因素。
17、 結(jié)論:
1、良性前列腺增生癥中前列腺組織的SOX9和NM23mRNA的表達(dá)值與前列腺癌中SOX9和NM23mRNA的表達(dá)值有顯著差異,通過檢測組織中SOX9和NM23mRNA的表達(dá)值可作為鑒別良性前列腺增生癥和前列腺癌的指標(biāo)。
2、前列腺癌組織中SOX9和NM23mRNA的表達(dá)值隨著Gleason評分,臨床分期,腫瘤惡性程度的不同而顯示出差異。SOX9mRNA表達(dá)值隨著Gleason評分,臨床分期和腫
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