植物NPR1及NPR1-like基因的克隆與功能分析.pdf

1、NPR1(nonexpressor of PR gene)基因可調(diào)控植物廣譜抗性的發(fā)生，在植物系統(tǒng)抗性中起著關(guān)鍵作用。植物NPR1基因已成為植物抗病信號(hào)傳導(dǎo)途徑，以及植物抗病基因工程領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。從不同植物中克隆NPR1基因及NPR1-like基因，并進(jìn)行基因表達(dá)特點(diǎn)和抗病功能的研究，對(duì)于豐富NPR1里論基礎(chǔ)和進(jìn)一步在植物抗病基因工程中的應(yīng)用都具有重要的意義。本文分別以棉花品種魯棉22和心葉煙為材料，從棉花植株中首次克隆出1個(gè)NPR1

2、同源基因(GhNPR1)，從心葉煙中首次克隆出2個(gè)NPR1同源基因(NgNPR1、NgNPR3)，在此基礎(chǔ)上，分別對(duì)它們的表達(dá)特點(diǎn)及其抗病的生物學(xué)功能進(jìn)行了分析。具體結(jié)果如下： 1.根據(jù)同源序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，通過(guò)RT-PCR和RACE-PCR的方法從棉花(Gossypium hirsutum)中克隆到一個(gè)NPR1基因，命名為GhNPR1，GenBank注冊(cè)號(hào)為EF988657。通過(guò)對(duì)其分子結(jié)構(gòu)和氨基酸結(jié)構(gòu)的對(duì)比分析，證明該基因?yàn)?/p>

3、NPR1的同源基因。Southern雜交說(shuō)明在棉花基因組中GhNPR1為單拷貝。Northern雜交發(fā)現(xiàn)GhNPR1在棉花中的表達(dá)不僅具有組織特異性而且還具有時(shí)間特異性。此外，植物抗病反應(yīng)相關(guān)信號(hào)分子SA、MeJA、ET可以誘導(dǎo)GhNPR1的表達(dá)，同樣給棉花接種棉花枯萎病菌和角斑病菌后，發(fā)現(xiàn)GhNPR1的表達(dá)量也逐步增加，進(jìn)一步證表明GhNPR1可能參與了棉花抗病反應(yīng)的基因表達(dá)調(diào)控。 2.從心葉煙(Nicotiana gluti

4、nosa)中同源克隆了NPR1基因，命名為NgNPR1，GenBank注冊(cè)號(hào)為EU139477。利用同源序列對(duì)比及分析，證明該基因?yàn)镹PR1的同源基因。并且通過(guò)NgNPR1-GFP亞細(xì)胞定位的研究，可以證明NgNPR1蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與AtNPR1蛋白最為相近。RT-PCR檢測(cè)NgNPR1表達(dá)特性時(shí)，發(fā)現(xiàn)NgNPR1基因可以被信號(hào)分子SA、MeJA、H2O2和INA誘導(dǎo)表達(dá)，而且細(xì)菌性病害青枯病和真菌病害煙草立枯病菌、黑莖病菌和赤星病菌接

5、種心葉煙后，也可以不同程度的增加NgNPR1的表達(dá)量。這表明NgNPR1基因可能是SA依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的成員，參與心葉煙抗病反應(yīng)的基因表達(dá)調(diào)控。 3.根據(jù)已知的NPR1及NPR1-like基因的同源序列，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，通過(guò)RT-PCR和RACE-PCR的方法從心葉煙(Nicotiana glutinosa)中克隆得到了一個(gè)壇NgNPR1-like基因，命名為NgNPR3，GenBank注冊(cè)號(hào)為EF077161。同源對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)

6、，NgNPR3與擬南芥中AtNPR3同源性最高，且氨基酸結(jié)構(gòu)中具有幾個(gè)高度保守的典型序列結(jié)構(gòu)。除此之外，NgNPR3基因組外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)位置的特征，也與已知的AtNPR3基因一致。因此推測(cè)NgNPR3基因是AtNPR3的同源基因。利用綠色熒光蛋白在洋蔥表皮瞬時(shí)表達(dá)的實(shí)驗(yàn)，證明了NgNPR3蛋白可以通過(guò)SA、INA誘導(dǎo)而引起細(xì)胞內(nèi)氧化還原電位勢(shì)的變化，從細(xì)胞質(zhì)運(yùn)動(dòng)到細(xì)胞核之中。Southern雜交說(shuō)明在心葉煙基因組中壇NgNPR3為單

7、拷貝。RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)分別利用信號(hào)分子SA、MeJA、H2O2和INA誘導(dǎo)，以及接種青枯病、立枯病菌、黑莖病菌和赤星病菌后，NgNPR3在心葉煙中的表達(dá)量都會(huì)出現(xiàn)明顯的增加，這意味著NgNPR3具有與NgNPR1基因相似的信號(hào)傳導(dǎo)和調(diào)控體系。 4.將NgNPR3構(gòu)建正義植物表達(dá)載體pBI121-NgNPR3，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，轉(zhuǎn)化煙草NC89，同時(shí)轉(zhuǎn)空載體作為對(duì)照。經(jīng)卡那霉素篩選獲得若干再生植株。經(jīng)過(guò)PCR鑒定，并選取部

8、分轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了Northern和Western雜交分析，結(jié)果證明NgNPR3在轉(zhuǎn)基因煙草中已成功得到表達(dá)。并且轉(zhuǎn)基因植株中存在三種不同的表達(dá)量，分別為高表達(dá)(H)、中表達(dá)(M)、低表達(dá)(L)。 5.選取具有代表性的三個(gè)T0代轉(zhuǎn)基因株系(H、M、L)進(jìn)行自交種子擴(kuò)繁，得到T1代轉(zhuǎn)基因植株。在分子鑒定基礎(chǔ)上，對(duì)T1代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了生物學(xué)功能分析?？拐婢鷮?shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)基因植株在接種了煙草白粉病菌后，其抗病能力與壇NPR3基因的表達(dá)量

9、成正比關(guān)系。即NgNPR3表達(dá)量高的植株(H、M)具有較高的抗性，低表達(dá)(L)植株與對(duì)照植株抗性很低。通過(guò)RT-PCR鑒定侵染后植株中PR基因的表達(dá)含量，證明高表達(dá)植株可以加快提高PR基因的表達(dá)，從而提高抗病能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明SAR誘導(dǎo)后NgNPR3基因也是誘導(dǎo)下游PR基因表達(dá)的重要調(diào)控因子。 6.構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-NgNPR3，并在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)融合蛋白，將特異誘導(dǎo)帶切下，溶于PBS中獲得抗原，免疫小鼠