家蠶RanBP5-like基因的克隆表達(dá)及功能分析.pdf

1、RanBPs(Ra.bindin.proteins)是細(xì)胞內(nèi)一類蛋白的總稱，其作用是調(diào)節(jié)Ran的作用在細(xì)胞內(nèi)得以正常的發(fā)揮。Ran是一種主要分布于細(xì)胞核內(nèi)的小分子蛋白質(zhì)，20世紀(jì)90年代被發(fā)現(xiàn)并證實(shí)具有GTP酶活性，通過分解GTP，調(diào)解下游的效應(yīng)分子，達(dá)到調(diào)節(jié)細(xì)胞生命活動(dòng)的目的。Ran的功能多種多樣，有許多證據(jù)表明Ran及其結(jié)合蛋白參與細(xì)胞周期中的多個(gè)過程。Ran于近幾年來(lái)逐步被確認(rèn)為一種重要的細(xì)胞增殖調(diào)控因子。
　　 我們從本

2、實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的家蠶蛹cDNA文庫(kù)中獲得一條cDNA序列，全長(zhǎng)為138.bp，基因登錄號(hào)為DN237073，其中ORF為94.bp，編碼314個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為3.kD，等電點(diǎn)為4.62。將該推測(cè)的氨基酸序列進(jìn)行同源性(BlastP)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與岡比亞按蚊(XP_310308)，谷蛀蟲(XP_967428)，果蠅(XP_001998194)，小鼠(BAE36521)，人(000410)中的Ra.bindin.protei.5具有同源性

3、，其同源性分別為49％，49％，47％，43％，42％，它們可能存在功能上的相似性。我們將家蠶中的該蛋白命名為RanBP5-like蛋白。
　　 為了研究該蛋白的功能，我們通過在上下游引物中分別加入Ba.HI和Xh.I酶切位點(diǎn)，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將該基因克隆到載體pET-28a中。PCR及雙酶切鑒定重組成功后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.col.BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后SDS-PAGE檢測(cè)，與陰性對(duì)照相比在3.kD處有一特異性

4、條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。重組蛋白以可溶的形式存在于上清中，經(jīng)鎳柱親和純化后，得到純化的RanBP5-like重組蛋白。純化的重組蛋白免疫新西蘭大白兔后制備得到多克隆抗體，經(jīng)ELISA檢測(cè)，抗體效價(jià)可達(dá)1：16000以上。利用該抗體通過Wester.blotting技術(shù)檢測(cè)家蠶各個(gè)發(fā)育階段和五齡蠶各個(gè)組織中RanBP5-like蛋白的表達(dá)和分布，結(jié)果顯示蛋白表達(dá)水平在蛹和精巢中的表達(dá)量最高，此外我們還利用熒光定量PCR的方法，對(duì)家蠶各個(gè)時(shí)期