家蠶RanBP5-like基因的克隆表達及功能分析.pdf

1、RanBPs(Ra.bindin.proteins)是細胞內一類蛋白的總稱，其作用是調節(jié)Ran的作用在細胞內得以正常的發(fā)揮。Ran是一種主要分布于細胞核內的小分子蛋白質，20世紀90年代被發(fā)現(xiàn)并證實具有GTP酶活性，通過分解GTP，調解下游的效應分子，達到調節(jié)細胞生命活動的目的。Ran的功能多種多樣，有許多證據(jù)表明Ran及其結合蛋白參與細胞周期中的多個過程。Ran于近幾年來逐步被確認為一種重要的細胞增殖調控因子。
　　 我們從本

2、實驗室構建的家蠶蛹cDNA文庫中獲得一條cDNA序列，全長為138.bp，基因登錄號為DN237073，其中ORF為94.bp，編碼314個氨基酸，預測分子量為3.kD，等電點為4.62。將該推測的氨基酸序列進行同源性(BlastP)比對，發(fā)現(xiàn)其與岡比亞按蚊(XP_310308)，谷蛀蟲(XP_967428)，果蠅(XP_001998194)，小鼠(BAE36521)，人(000410)中的Ra.bindin.protei.5具有同源性

3、，其同源性分別為49％，49％，47％，43％，42％，它們可能存在功能上的相似性。我們將家蠶中的該蛋白命名為RanBP5-like蛋白。
　　 為了研究該蛋白的功能，我們通過在上下游引物中分別加入Ba.HI和Xh.I酶切位點，經(jīng)PCR擴增后，將該基因克隆到載體pET-28a中。PCR及雙酶切鑒定重組成功后轉化感受態(tài)細胞E.col.BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導表達后SDS-PAGE檢測，與陰性對照相比在3.kD處有一特異性

4、條帶，與預期結果一致。重組蛋白以可溶的形式存在于上清中，經(jīng)鎳柱親和純化后，得到純化的RanBP5-like重組蛋白。純化的重組蛋白免疫新西蘭大白兔后制備得到多克隆抗體，經(jīng)ELISA檢測，抗體效價可達1：16000以上。利用該抗體通過Wester.blotting技術檢測家蠶各個發(fā)育階段和五齡蠶各個組織中RanBP5-like蛋白的表達和分布，結果顯示蛋白表達水平在蛹和精巢中的表達量最高，此外我們還利用熒光定量PCR的方法，對家蠶各個時期