唐菖蒲再生體系建立及NPR1基因的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、菖蒲(Gladiolus hybridus)是鳶尾科唐菖蒲屬多年生單子葉球根花卉，是世界著名的四大切花之一。唐菖蒲的切花生產(chǎn)是以無性繁殖的方式生產(chǎn)球莖作為栽培材料，因此附著在球莖上的致病菌會不斷傳染給后代種球，經(jīng)過多年積累導(dǎo)致種球種植過程中病害嚴重發(fā)生。 應(yīng)用抗病品種是病害防治最直接有效的方法，但唐菖蒲抗病種質(zhì)資源匱乏加之常規(guī)育種周期長，使得抗病品種遠遠不能滿足生產(chǎn)上的需求。隨著生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，運用基因工程手段將外源抗病基因

2、導(dǎo)入植物中，為唐菖蒲抗病育種帶來了新的希望。 本研究在由唐菖蒲球莖芽誘導(dǎo)出的胚性愈傷組織基礎(chǔ)上，建立了胚性愈傷組織經(jīng)器官發(fā)生途徑和經(jīng)體細胞胚發(fā)生途徑兩套再生體系，并對器官發(fā)生途徑中不定芽的壯苗培養(yǎng)和體細胞胚發(fā)生途徑中胚狀體的發(fā)育過程進行了較深入的研究。在此基礎(chǔ)上以唐菖蒲愈傷組織為基因轉(zhuǎn)化受體，將植物廣譜抗病基因(NPRl基因)通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化唐菖蒲，建立了穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系，得到了經(jīng)PCR檢測為剛性的植株。本研究的主要結(jié)果如下

3、： 1．唐菖蒲愈傷組織經(jīng)器官發(fā)生途徑再生體系：以球莖芽切片為外植體，胚性愈傷組織誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為MS+2，4-D4mg/L+6-BA0.5mg/L，誘導(dǎo)率達95％；不定芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為 MS+6.BA0.5mg/L+NAA0/1mg/L，誘導(dǎo)率達 92/7％；壯苗培養(yǎng)基為1/4MS+PP333lm/L+NAAlmg/L+蔗糖50g/L，壯苗率達100％，生根培養(yǎng)基為MS+IBA1.5mg/L，生根率達100％，移栽成活率達10

4、0％。 2．唐菖蒲愈傷組織經(jīng)體細胞胚發(fā)生途徑再生體系：以球莖芽切片為外植體，胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2，4-D4.0mg/L+6-BA0.5 mg/L；胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2，4-D1.0mg/L+TDZ0.2mg/L+蔗糖30g/L+甘露醇30g/L，誘導(dǎo)率為68.3％；將產(chǎn)生的胚狀體首先接種于MS培養(yǎng)基使其充分發(fā)育，之后轉(zhuǎn)入MS+6.BA2.0mg/L培養(yǎng)基中誘導(dǎo)發(fā)芽，在轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基中使其形成完整植株。通過石蠟切

5、片法和臨時壓片法對胚狀體的發(fā)育過程觀察發(fā)現(xiàn)，首先外植體表層薄壁細胞經(jīng)脫分化恢復(fù)分生能力，形成愈傷組織，隨后在愈傷組織表面形成許多瘤狀突起即胚性細胞團，胚性細胞團繼續(xù)發(fā)育成球形胚、盾形胚，最后發(fā)育成熟形成完整植株。 3．唐菖蒲遺傳轉(zhuǎn)化體系：以胚性愈傷組織為基因轉(zhuǎn)化受體，將胚性愈傷組織預(yù)培養(yǎng)14天后用濃度為OD600=03205～0.5的農(nóng)桿菌菌液侵染10～15min，侵染的愈傷組織與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)3天后，用250mg/L的頭孢霉素進