端粒酶活性變化在動脈粥樣硬化斑塊發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制.pdf

1、目的:
　　血管鈣化，尤其是動脈粥樣硬化鈣化是心腦血管疾病的重要因素之一。血管鈣化是一個由多種細胞啟動并與骨發(fā)育類似的、主動的、高度可調(diào)控的、可預(yù)防和可逆轉(zhuǎn)的生物學(xué)過程。目前鈣化形成理論有骨形成蛋白調(diào)節(jié)、脂質(zhì)代謝紊亂、凋亡體基質(zhì)囊泡和氧化應(yīng)激等多種機制，但相關(guān)的分子機制尚不完全清楚。血管鈣化主要是中層血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)的鈣化。血管平滑肌細胞表達少量端粒酶(telo

2、merase)，有研究表明動脈粥樣硬化斑塊VSMCs的端粒(telomere)長度明顯短于正常血管VSMCs，端粒酶活性也明顯低，但端粒酶活性變化的調(diào)控機制及其在血管鈣化中的作用并不清楚。
　　研究表明，NF-κB炎癥信號通路促進骨形成蛋白(bone morphogenetic protein2，BMP2)和成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(runt-related transcription factor2，RUNX2)的表達，促進VSMCs鈣

3、化結(jié)節(jié)形成。研究發(fā)現(xiàn)核不均一核糖蛋白A1(heterogeneous nuclear ribonucleo protein A1，hnRNP A1)可通過結(jié)合IκBα介導(dǎo)其發(fā)生蛋白酶體水解，促進NF-κB入核，激活炎癥信號通路。hnRNP A1是hnRNPs家族中含量最為豐富的一類蛋白，通過調(diào)控mRNA合成過程如mRNA轉(zhuǎn)錄、剪接、穩(wěn)定性以及mRNA從胞核到胞漿轉(zhuǎn)運過程進而調(diào)控靶基因的表達。我們的前期工作發(fā)現(xiàn)，在血管平滑肌細胞由收縮型向

4、合成型轉(zhuǎn)變的過程中，人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)和hnRNP A1的表達均顯著上調(diào)。有文獻報道hnRNP A1可以延長細胞端粒長度，防止端粒過度損耗引發(fā)的細胞早衰。因此，本研究擬闡明hnRNP A1是否可以調(diào)控血管平滑肌細胞端粒酶活性和IκBα/NF-κB信號通路從而影響血管平滑肌細胞的鈣化過程。
　　方法:
　　1.分離培養(yǎng)原代人臍動脈血管平滑

5、肌細胞(human umbilical artery smooth muscle cells，HUASMCs)，構(gòu)建pcDNA3.1-hnRNP A1真核表達載體并轉(zhuǎn)染HUASMCs，通過端粒重復(fù)擴增法(telomeric repeat amplification protocol，TRAP)、細胞增殖實驗（MTS法）與流式細胞儀分別檢測hnRNPA1對HUASMCs端粒酶活性、增殖和凋亡功能的影響。
　　2.建立HUASMCs鈣

6、化模型，通過實時熒光定量PCR和Western blot法檢測NF-κB信號通路調(diào)控HUASMCs鈣化相關(guān)的各基因表達，闡明hnRNP A1在血管平滑肌鈣化過程中的作用機制。
　　結(jié)果:
　　1.體外培養(yǎng)HUASMCs結(jié)果表明，在HUASMCs由收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚偷姆只^程中，端粒酶和hnRNP A1的表達水平均顯著上調(diào)。過表達hnRNP A1顯著上調(diào)端粒酶活性2.7倍，但對HUASMCs細胞的增殖和凋亡功能無顯著影響。