α-硫辛酸對杏仁核電點燃慢性癲癇大鼠海馬CaMKIIa表達的影響.pdf

1、目的:癲癇是指神經(jīng)元自發(fā)的，反復的，刻板的放電發(fā)作。癲癇可以導致認知、情感、行為方面異常。癲癇病灶部位、發(fā)作類型及社會心理因素均可影響認知，近幾年研究發(fā)現(xiàn)抗癲癇藥物本身也有導致認知損傷的副作用。氧化應激參與了許多神經(jīng)變性疾病的生理病理過程，近來研究發(fā)現(xiàn)氧化應激同樣存在于癲癇的發(fā)病機制之中。癲癇發(fā)作過程伴有氧自由基生成增多，大腦是脂質(zhì)過氧化物敏感的器官，其中海馬神經(jīng)元氧化應激損傷是癲癇大鼠認知功能障礙發(fā)生、發(fā)展的重要因素之一。α-硫辛酸(

2、α-LipoicacidALA)是一種體內(nèi)強抗氧化劑，具有潛在的預防和治療癲癇所致認知功能障礙的作用。目前α-硫辛酸多用于用來預防甚至治療某些疾病如:糖尿病及其并發(fā)癥、神經(jīng)系統(tǒng)退化及肝功能失調(diào)等癥狀。而α-硫辛酸在改善癲癇所致的認知障礙中的作用尚未見報道。本實驗通過建立杏仁核電點燃慢性癲癇大鼠模型，并給予α-硫辛酸干預，用WesternBlot方法觀察鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱa(calciurn/calmodulindependent

3、proteinkinaseⅡa，CaMKⅡa)及磷酸化鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱa(P-CaMKⅡa)蛋白在海馬組織中的表達水平，用免疫組織化學方法觀察磷酸化鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱa(P-CaMKⅡa)在大鼠海馬組織中的蛋白表達水平及分布情況，用Nissl染色方法觀察大鼠海馬組織的形態(tài)學情況，并用Morris水迷宮檢測大鼠學習記憶能力。初步探討α-硫辛酸對癲癇認知障礙有無神經(jīng)保護作用及其可能的作用機制。
　　方法:將72只7-

4、8周，體重250-300g之間，成年雄性Wistar大鼠隨機分為:正常對照組(NC組)、假手術(shù)組（S組）、癲癇組（E組）、正常α-硫辛酸組(ALA組)、α-硫辛酸低劑量組（20mg/kgALA+E組）和α-硫辛酸高劑量組（40mg/kgALA+E組），每組各12只大鼠。正常對照組:不做任何處理;假手術(shù)組:杏仁核植入電極;癲癇組:杏仁核植入電極后每天按120％發(fā)作閾值刺激一次;正常α-硫辛酸組:不做任何處理的大鼠硫辛酸按40mg/kg腹腔

5、注射;α-硫辛酸低劑量組和α-硫辛酸高劑量組:于每天上午08:30-09:30之間分別腹腔注射α-硫辛酸20mg/kg和α-硫辛酸40mg/kg，藥物注射完30min后，按120％發(fā)作閾值刺激1次/日，共15次。結(jié)束后觀察1小時。依據(jù)Becker等改良的Racine分級標準觀察:0級:無任何反應，呈正常的行為狀態(tài);1級:濕狗樣抖動、面肌痙攣如眨眼、動須及節(jié)律性咀嚼;2級:頸部肌肉痙攣表現(xiàn)為點頭和（或）甩尾;3級:一側(cè)前肢陣攣;4級:雙側(cè)

6、前肢陣攣伴站立;5級:全身陣攣，失去平衡，跌倒。連續(xù)3次獲得Ⅳ級或Ⅳ級以上的運動性驚厥的大鼠為完全點燃。最后一次給藥結(jié)束后24小時，行Morris水迷宮檢測，實驗前1天大鼠在水池內(nèi)自由游泳2min，熟悉環(huán)境。實驗包括(1)可視平臺實驗:為排除實驗處理因素對動物實驗感覺、視覺、知覺及運動功能的差異對空間學習記憶的影響，采用可視平臺對大鼠進行測試。平臺升至液面上2cm，每只大鼠釋放4次，分別從不同的4個入水點入水，記錄大鼠的逃避潛伏期。(2

7、)定位航行實驗:用于測試大鼠的學習能力。正式實驗歷時4天。以后4天每天分上、下午兩個時間段，每段訓練4次，中間間隔＞2h。訓練時隨機選取一個象限中心作為入水點，將大鼠面向池壁輕輕放入水中，每個時間段4次訓練分別從4個不同的入水點入水。記錄大鼠從入水到爬上水下平臺的時間，即逃避潛伏期。如120s大鼠仍未找到平臺，由操作者將大鼠引上平臺休息30s，并將潛伏期記錄為120s，兩次訓練中間間隔60s;(3)空間探索實驗:用于測試大鼠的空間記憶能

8、力。定位航行實驗完畢的第二天，將平臺撤除，選定和平臺區(qū)域相對的象限中點為入水點，記錄大鼠在120s內(nèi)為搜尋平臺而穿越平臺的次數(shù)。行為學測試結(jié)束后:(1)每組各取6只大鼠灌注取腦，Nissl染色觀察大鼠海馬神經(jīng)元細胞形態(tài)及損傷情況。同時用免疫組織化學方法檢測P-CaMKⅡa在海馬CA1區(qū)的表達情況;(2)每組另取6只大鼠，斷頭取腦，快速分離海馬，用Westerblot方法檢測海馬CaMKⅡa及P-CaMKⅡa蛋白水平變化。
　　結(jié)果

9、:
　　1、水迷宮結(jié)果:可視平臺試驗:NC組、ALA組、S組、E組大鼠、20mg/kgALA+E組及40mg/kgALA+E組之間比較逃避潛伏期無明顯統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。
　　定位航行實驗:以各組大鼠每日逃避潛伏期均值進行比較。(1)第1天，E組大鼠的逃避潛伏期與NC組相比有所延長;與E組相比，20mg/kgALA+E組、40mg/kgALA+E組、ALA組、S組的逃避潛伏期均有所縮短，但各組間比較無統(tǒng)計學意義（P＞

10、0.05）。(2)第2天，各組大鼠逃避潛伏期均比第1天明顯縮短（P＜0.05）;E組大鼠的逃避潛伏期與NC組相比明顯延長（P＜0.05）;與E組相比，20mg/kgALA+E組、40mg/kgALA+E組、ALA組、S組的逃避潛伏期均有所縮短（P＜0.05），但與NC組比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。(3)第3天，各組大鼠逃避潛伏期均比第2天明顯縮短(P＜0.05);NC組、E組、20mg/kgALA+E組、40mg/kgALA+E組

11、、ALA組、S組的逃避潛伏期相互比較結(jié)果與第2天相同。(3)第4天，各組大鼠逃避潛伏期均比第3天又有明顯縮短(P＜0.05);NC組、E組、20mg/kgALA+E組、40mg/kgALA+E組、ALA組、S組的逃避潛伏期相互比較結(jié)果與第3天相同。
　　空間探索試驗:E組大鼠與NC組大鼠相比，穿越平臺次數(shù)明顯減少(p＜0.05);與E組相比，20mg/kgALA+E組及40mg/kgALA+E組穿越平臺次數(shù)明顯增多(p＜0.05)

12、，且與NC組、ALA組、S組比較無明顯統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。
　　2、Nissl染色結(jié)果:NC組、ALA組及S組大鼠的海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，細胞漿內(nèi)尼氏小體豐富，染色質(zhì)分布均勻，核仁清晰，無明顯神經(jīng)元丟失;與NC組相比，E組大鼠海馬細胞皺縮，胞漿內(nèi)尼氏小體明顯減少，染色質(zhì)凝集成塊、核固縮、神經(jīng)元丟失明顯;20mg/kgALA+E組及40mg/kgALA+E組海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常，有少量染色質(zhì)凝集，胞漿內(nèi)尼氏小體較E組顯著增加，僅

13、少量神經(jīng)元丟失。
　　3、免疫組化結(jié)果:P-CaMKⅡa蛋白在海馬組織中的陽性細胞顯示為棕褐色，主要在細胞的胞漿內(nèi)表達。E組的P-CaMKⅡa在海馬表達的陽性細胞數(shù)較NC組明顯降低（P＜0.05）。與E組比較，20mg/kgALA+E組和40mg/kgALA+E組的P-CaMKⅡa蛋白在海馬表達的陽性細胞數(shù)明顯升高（P＜0.05）。且20mg/kgALA+E組及40mg/kgALA+E組與NC組、ALA組、S組之間比較無明顯統(tǒng)計學

14、差異（P＞0.05）。
　　4、Westernblot檢測結(jié)果:CaMKⅡa蛋白在各組大鼠海馬表達水平以CaMKⅡa/GAPDH表示。E組CaMKⅡa蛋白表達水平較NC組明顯降低(P＜0.05)。20mg/kgALA+E組和40mg/kgALA+E組的CaMKⅡa蛋白表達水平較E組明顯升高（P＜0.05）。S組、NC組、ALA組、20mg/kgALA組+E組及40mg/kgALA組+E組之間比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

15、>　　P-CaMKⅡa蛋白在各組大鼠海馬表達水平以P-CaMKⅡa/GAPDH表示。E組P-CaMKⅡa蛋白表達水平較NC組明顯降低（P＜0.05）。20mg/kALA+E組和40mg/kgALA+E組的P-CaMKⅡa蛋白表達水平較E組明顯升高（P＜0.05）。S組、NC組、ALA組、20mg/kgALA組+E組及40mg/kgALA組+E組之間比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　結(jié)論:
　　1、本實驗采用杏仁核電點燃

16、慢性癲癇大鼠模型可以很好地模擬人類癲癇后認知功能障礙，是研究癲癇后認知障礙的理想模型。
　　2、癲癇可導致CaMKⅡa和P-CaMKⅡa蛋白表達下降，并導致腦組織受損，提示CaMKⅡa及P-CaMKⅡa可能與癲癇后認知障礙相關(guān)。
　　3、α-硫辛酸可以上調(diào)癲癇后海馬組織中CaMKⅡa及P-CaMKⅡa蛋白的表達水平，改善癲癇后認知障礙，并減輕腦組織的損害，提示α-硫辛酸可改善癲癇后認知障礙并對腦組織有一定保護作用，這種作用可