硫辛酸對(duì)EAE大鼠ICAM-1、TNF-α及BBB影響的研究.pdf

1、目的：血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)完整性的破壞已成為實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)和人類多發(fā)性硬化(multiplesclerosis，MS)發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用硫辛酸(lipoic acid LA)治療Wistar大鼠EAE，觀察BBB的功能變化及細(xì)胞間粘附分子-1(intercellular adhens

2、ion molecule-1，ICAM-1)和腫瘤壞死因子-α(tutnor necrosis factor alpha，TNF-α)表達(dá)的變化，研究ICAM-1、TNF-α與BBB的相互關(guān)系及其在EAE中的作用。探討EAE的發(fā)病機(jī)制和應(yīng)用LA治療EAE的作用機(jī)制，為EAE和MS的免疫病理機(jī)制提供新的理論支持，也為今后臨床應(yīng)用硫辛酸輔助治療MS等CNS自身免疫性疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：制備EAE動(dòng)物模型，隨機(jī)分為EAE組、LA

3、治療組和佐劑組。LA治療組從免疫后(post-inoculation，p.i.)0～5天每日腹腔注射LA(100mg/kg)一次。觀察各組在不同時(shí)間點(diǎn)血清和腦脊液中白蛋白含量比值(CSF to serum albumin quotient，QA)，通過QA評(píng)定BBB的損害。按照國(guó)際通用的五分法評(píng)估臨床癥狀，觀察體重變化、發(fā)病率等臨床指標(biāo)。在p.i.6、8、10、12、14、16天處死動(dòng)物，取腦和脊髓用免疫組化技術(shù)檢測(cè)CNS中不同部位IC

4、AM-1和TNF-α的表達(dá)，并對(duì)EAE組ICAM-1和TNF-α噸進(jìn)行相關(guān)分析。 結(jié)果：1.EAE組、LA治療組于p.i.8d前無(wú)任何癥狀，臨床癥狀評(píng)分為0，在p.i.8-11d開始出現(xiàn)輕度異常，主要表現(xiàn)為活動(dòng)減少、食欲減低、皮毛松、毛色差、體重輕度下降，但尚未出現(xiàn)尾麻痹，臨床癥狀評(píng)分為0，在p.i.12天開始出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，起病突然，發(fā)病輕重不一，表現(xiàn)有尾麻痹、后肢無(wú)力、體重下降等。在p.i.14天達(dá)高峰，表現(xiàn)為后肢癱瘓、

5、易激惹、體重迅速下降，個(gè)別處于瀕死狀態(tài)。在p.i.16天左右病情開始緩解，臨床癥狀減輕，體重開始回升，相應(yīng)的臨床癥狀評(píng)分、發(fā)病率下降。EAE組發(fā)病率73％，LA治療組20％，較EAE組降低(X2=8.57，P<0.01)；EAE組平均體重減輕15.06±4.20g，LA治療組減輕7.07±3.75g，較EAE組減少(t=5.54，P<0.01)；EAE組平均高峰期評(píng)分2.07±1.67分，LA治療組0.60±1.12分，較EAE組降低(

6、t=3.259，P<0.01)；EAE組平均病灶數(shù)15.20±2.11個(gè)，LA治療組6.93±3.20個(gè)，較EAE組減少(t=8.36，P<0.01)；EAE組平均起始發(fā)病時(shí)間13.73±1.22天，LA治療組15.07±0.96天，較EAE組延遲(t=3.32,P<0.01)。這5項(xiàng)臨床指標(biāo)比較，LA治療組與EAE組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。佐劑組未見發(fā)病，體重呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。 2.EAE組、LA治療組和佐劑組QA值均出現(xiàn)先升高后下降的變化

7、趨勢(shì)。EAE組QA值在p.i.6天已經(jīng)有增高(0.19±0.01)，在p.i.8天時(shí)，QA值達(dá)到最大值(0.31±0.07)，表明此時(shí)BBB的破壞達(dá)到高峰，但此時(shí)動(dòng)物尚未出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，提示BBB的破壞早于臨床癥狀的發(fā)生。后QA值下降，BBB功能逐漸恢復(fù)。LA治療組在p.i.6～12天QA值呈緩慢增高趨勢(shì)，p.i.14天達(dá)高峰(0.20±0.04)，但QA值增幅較EAE組小且出現(xiàn)峰值的時(shí)間較EAE組延遲，表明LA治療后BBB受損較輕

8、。佐劑組QA值在免疫后初期(p.i.8d)雖然也出現(xiàn)增高(0.13±0.03)，但升高幅度明顯低于EAE組。經(jīng)兩因素多水平方差分析統(tǒng)計(jì)表明：在p.i.6～16天，EAE組與LA治療組比較QA值總的變化趨勢(shì)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=16.51，P<0.01)；EAE組與佐劑組比較QA值總的變化趨勢(shì)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=17.10，P<0.01)。 3.ICAM-1在EAE組、LA治療組和佐劑組的血管內(nèi)皮細(xì)胞中均有表達(dá)，且表達(dá)程度與病情輕重相一

9、致。當(dāng)其表達(dá)增加時(shí)，表現(xiàn)為在扁平的血管內(nèi)皮細(xì)胞周圍著色加深。經(jīng)圖像分析顯示，EAE組ICAM-1陽(yáng)性染色平均灰度值在p.i.14天時(shí)達(dá)到最小值(130.73±16.27)，此時(shí)LA治療組也有所下降(153.10±16.22)，但下降較緩慢，與EAE組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。經(jīng)兩因素多水平方差分析統(tǒng)計(jì)表明：在p.i.10～16天，EAE組與LA治療組ICAM-1陽(yáng)性染色平均灰度值比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，表明LA治療組I

10、CAM-1表達(dá)明顯低于EAE組；在p.i.10～16天，EAE組與佐劑組ICAM-1陽(yáng)性染色平均灰度值比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，表明EAE組ICAM-1的表達(dá)明顯高于佐劑組。 4.TNF-α主要由活化的單核-巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、NK和肥大細(xì)胞產(chǎn)生，免疫組化染色陽(yáng)性表達(dá)表現(xiàn)為血管滲出的淋巴細(xì)胞周圍有不同程度著色，且表達(dá)程度與病情輕重相-致。經(jīng)圖像分析顯示，EAE組TNF-a陽(yáng)性染色平均灰度值在p.i.14天時(shí)達(dá)到最小值114

11、.99±19.29，此時(shí)LA治療組也有所下降(137.57±17.63)，但下降較緩慢，與EAE組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。經(jīng)兩因素多水平方差分析統(tǒng)計(jì)表明：在p.i.10～16天，EAE組與LA治療組TNF-a陽(yáng)性染色平均灰度值比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，表明LA治療組TNF-a表達(dá)明顯低于EAE組；在p.i.10～16天，EAE組與佐劑組TNF-α陽(yáng)性染色平均灰度值比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，表明EAE組TNF-

12、α的表達(dá)明顯高于佐劑組。相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析顯示：在p.i.6～p.i.16天，EAE組ICAM-1與TNF-a的陽(yáng)性表達(dá)具有顯著正相關(guān)性(r=0.82，P<0.01)。 結(jié)論： 1.BBB損傷先于EAE臨床癥狀出現(xiàn)之前。 2.EAE不同時(shí)期EC表面ICAM-1及CNS內(nèi)TNF-α的表達(dá)與臨床癥狀的嚴(yán)重程度相一致。 3.TNF-α與ICAM-1的表達(dá)具有正相關(guān)性。 4.LA通過下調(diào)ICAM-1和TNF-α